咖啡酸改性明胶水凝胶制备及其抗氧化功能

郝博雅，曾 菲，温 涛，孟 洁，许海燕，刘 健

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物医学工程学系，北京 100005)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一类高反应活性的含氧化合物和自由基的总称，细胞正常代谢过程中会产生ROS以调控其多种功能，但ROS过度产生或内源性抗氧化剂不足会导致被细胞内氧化还原状态失衡，引起氧化应激反应，与创面感染[1]、心肌梗死[2]以及脊髓损伤[3]等多种疾病的发生发展有关；此外，在细胞疗法中高ROS微环境还会导致植入细胞存活率降低[4]。将小分子抗氧化剂与高分子结合可制备抗氧化高分子材料，其中最具代表性的是抗氧化水凝胶，在心肌修复[5]、伤口愈合[1]以及细胞疗法[6]等方面被广泛研究。

没食子酸[7]和咖啡酸[8]等酚酸修饰的明胶水凝胶具有良好的抗氧化性，特别是咖啡酸具有-CH=CH-COOH基团，具有良好的供氢能力和稳定自由基的能力[9]，且对维细胞毒性较小[10]。漆酶是一种多酚氧化酶，可催化氧化酚类及苯胺类，本身具有良好的生物相容性[11]。本文合成了不同接枝率的咖啡酸改性明胶(caffeic acid-grafted gelatin, CA-gel)，并以漆酶为交联剂制备水凝胶；研究了接枝率对固化时间、弹性模量、溶胀度、降解速率和自由基清除能力等性能的影响，评价了CA-gel水凝胶的细胞相容性及在过氧化氢环境中对成纤维细胞的保护作用，以期为ROS稳态相关疾病的细胞治疗提供新型抗氧化水凝胶。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；A型明胶(gelatin)、漆酶(来源于曲霉属，laccase)、Ⅰ型胶原酶(Sigma-Aldrich公司)；咖啡酸(caffeic acid，CA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、2-吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid，MES)、30%过氧化氢(H2O2)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)(日本同仁化学公司)。

1.2 方法

1.2.1 咖啡酸改性明胶合成:将一定量咖啡酸溶解在75 mL含50%(v∶v)DMSO的MES缓冲液(0.1 mol/L，pH 5.5)中，加入EDC HCl和NHS，室温活化15 min后加入20 mmol/L β-巯基乙醇终止反应。将0.6 g明胶溶解在60 mL含50% DMSO的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4)中，与活化后的咖啡酸溶液混合，咖啡酸与明胶的投料比为1.875、2.500、3.125 mmol/g(投料时按照明胶质量和咖啡酸的摩尔比进行)，于40 ℃水浴中反应8 h后使用超纯水透析4 d(MWCO 3 500 Da，MD 77 mm)，冷冻干燥。三种比例的咖啡酸改性明胶(caffeic acid-grafted gelatin，CA-gel)分别命名为CA-gel-1、CA-gel-2、CA-gel-3。

1.2.2 咖啡酸改性明胶表征:结构分析：使用高效液相色谱法(Thermo，Ultimate 3000)和核磁共振氢谱法(Bruker 400M)分析CA-gel中咖啡酸与明胶分子的结合。

接枝率：使用紫外-可见分光光度仪(Lambda 950)，以超纯水校准基线，扫描1 mg/mL明胶和CA-gel水溶液的吸光度，扫描范围为250～400 nm，步长为1 nm。测定CA-gel在319 nm处吸光度值，通过标准曲线定量CA-gel中咖啡酸接枝率。

1.2.3 水凝胶制备及固化时间测定:称取CA-gel溶于超纯水中，加入漆酶混合，漆酶终浓度为20 LAMU/mL，CA-gel终浓度为5%。置于37 ℃孵箱，采用倒置试管法观察，将液体停止流动的时间记为固化时间。水凝胶固化前后使用数码相机拍照记录。将水凝胶于液氮中淬断，表面喷金，使用扫描电子显微镜(Hitachi SU8200)观察其微观结构。

1.2.4 水凝胶力学性能:基于改良的微球压痕法[12]原理测定水凝胶杨氏模量，于西林瓶中制备水凝胶，将钢球(直径5 mm，质量0.5 g)放置在于凝胶表面，使用接触角测量仪(KRUSS DSA100)拍照，通过照片比对得到微球放置后水凝胶表面下陷的深度及微球与水凝胶接触面上缘的水平半径，进而计算出水凝胶的弹性模量E。所使用的公式如下：

其中，v为水凝胶的泊松比(此处取0.5)，P为微球重量，a为微球与水凝胶接触面上缘的水平半径，h为水凝胶表面下陷的深度。

1.2.5 水凝胶溶胀率测定:称取一定质量冻干水凝胶，加入超纯水溶胀48 h后，取出吸去表面水分测定质量。溶胀率按如下公式计算：

其中m0为冻干凝胶质量，m1是凝胶溶胀后质量。

1.2.6 水凝胶体外降解实验:称取一定质量冻干凝胶，加入含0.05% Ⅰ型胶原酶的磷酸盐缓冲液，在37 ℃下孵育，定期去除胶原酶溶液并将剩余水凝胶冻干称重。剩余水凝胶比例按如下公式计算：

其中W1和W0分别是降解后剩余水凝胶和初始水凝胶的质量。

1.2.7 水凝胶清除自由基1，1-二苯基-2-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH·)能力:使用0.5%戊二醛交联的明胶作为对照组，明胶终浓度为5%。将200 μL水凝胶放入1 mL 0.3 mmol/L DPPH·乙醇溶液中，避光孵育1 h，吸出上清并使用酶标仪测定其在517 nm处的吸光度值。水凝胶对DPPH·的清除率按如下公式计算：

其中，A0为未加入水凝胶的DPPH·乙醇溶液的吸光度值，An为与水凝胶孵育后的DPPH·乙醇溶液的吸光度值。每种材料均设3个平行。

1.2.8 水凝胶细胞毒性:向100 μL CA-gel水凝胶中加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃浸提24 h，使用0.22 μm滤膜过滤得到浸提液。将NIH3T3细胞接种于96孔板中(1×104个/孔)，过夜贴壁后每孔加入200 μL浸提液，培养24 h；使用CCK-8试剂盒检测细胞活力，每孔加入110 μL CCK-8工作液，37℃孵育3 h，使用酶标仪(Epoch，BioTek Instruments)测定其在450 nm处吸光度。

1.2.9 细胞保护实验:将NIH3T3细胞接种在24孔板中(5×104个/孔)，培养24 h后对照组更换新鲜正常培养基，阳性对照组加入含200 μmol/L H2O2的新鲜培养基，实验组加入含H2O2的新鲜培养基后再将水凝胶轻置于细胞上，培养24 h后去除培养基和水凝胶，用PBS清洗2次，使用CCK-8试剂盒检测细胞活性，每孔加入300 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪测定其在450 nm处吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 咖啡酸改性明胶合成与表征

利用EDC/NHS反应，使明胶的氨基与咖啡酸的羧基反应形成酰胺键，将咖啡酸接枝在明胶上。由高效液相色谱图可见，咖啡酸改性明胶分子在319 nm出现了咖啡酸的特征吸收峰(图1A)；1H-NMR谱(图1B)显示，CA-gel中存在咖啡酸苯环氢原子，其中7.13 ppm代表C-a处的氢原子，6.92 ppm代表C-c处的氢原子，6.82 ppm代表C-b处的氢原子，表明咖啡酸被接枝到了明胶大分子上。以紫外-可见光谱中319 nm处吸光度对CA-gel中咖啡酸定量，可以看出随着咖啡酸和明胶投料比的增加，咖啡酸接枝率提高，CA-gel-1、CA-gel-2、CA-gel-3的接枝率分别为33.0、61.8、74.4 μmol/g(图1C)。

2.2 水凝胶的制备及固化时间测定

成胶实验结果显示，咖啡酸接枝率越高，所需固化时间越长，CA-gel-1、CA-gel-2、CA-gel-3的平均固化时间分别为33 min、42 min、47 min(图2A)；图2B是使用数码相机拍摄的CA-gel成胶前后的照片。扫描电子显微镜观察显示，水凝胶具有疏松多孔结构(图2C)。

2.3 水凝胶的理化性质

图3A是微球压痕法中微球放置前后的照片；研究结果显示，三种水凝胶的弹性模量分别为7.2、29.4和34.5 kPa(1 mmHg=0.133 kPa)(图3B)，其平衡溶胀度分别为896.5%、835.3%和803.9%(图3C)，表明随着明胶分子咖啡酸接枝率的提高，CA-gel水凝胶的弹性模量逐渐增加，而平衡溶胀度逐渐降低。此外，咖啡酸接枝率也会影响CA-gel水凝胶的生物降解性，随着咖啡酸接枝率的提高，水凝胶的降解速度逐渐变慢，三种水凝胶分别在60、90和200 min完全降解(图3D)。特别重要的是，咖啡酸的引入显著提高了明胶水凝胶的DPPH·清除能力，明胶水凝胶对DPPH·清除率仅为18.0%，而CA-gel-1、CA-gel-2、CA-gel-3三种水凝胶对DPPH·清除率分别达到了38.5%、41.9%和49.8%(图3E)。

2.4 水凝胶具有良好的细胞相容性和对细胞的保护功能

与对照组相比，3种水凝胶的浸提液对细胞活性均无显著影响，显示了良好的细胞相容性(图4A)。当在培养基中加入H2O2时，在阳性对照组中，200 μmol/L H2O2使NIH3T3细胞的活力下降至63.6%，相比之下，CA-gel水凝胶处理组显著提高了细胞的存活率，明胶水凝胶组细胞活力值为76.0%，而CA-gel-1、CA-gel-2、CA-gel-3三种水凝胶处理组的细胞活力分别为：96.5%、94.0%和96.0%，与正常对照组无显著性差异(图4B)，表明CA-gel水凝胶可以有效降低H2O2引起的细胞死亡，具有保护细胞免受氧化应激损伤的潜力。

A.HPLC diagrams of gelatin and CA-gel-2; B.1H-NMR spectra of gelatin and CA-gel-2; C.UV-Vis spectra of gelatin, CA and CA-gel

A.gelation times of CA-gel hydrogels; B.appearance of CA-gel hydrogel; C.microscopic observation of CA-gel hydrogel by scanning electron microscopy;scale bar:200 μm

A.determination of elastic modulus of hydrogels by microsphere indentation method; B.elastic modulus of CA-gel hydrogels; C.swelling ratios of CA-gel hydrogels; D.degradation rates of CA-gel hydrogels; E.scavenging effects on DPPH· by CA-gel hydrogels；*P<0.01, **P<0.001 compared with gelatin hydrogel group

A.effects of CA-gel hydrogel extract on fibroblasts; B.protective effects of CA-gel hydrogels on fibroblasts in the high oxidative stress microenvironment; *P<0.001 compared with positive control group; #P<0.05 compared with gelatin hydrogel group

3 讨论

明胶具有良好的生物相容性，其分子中具有大量RGD序列，有利于细胞黏附和生长，同时分子中含有大量氨基等可反应性的官能团，适合于进行各类共价修饰，因此是一种优异的组织工程学材料。咖啡酸中的邻二酚羟基可以提供氢原子或电子稳定自由基，形成半醌自由基，并最终形成邻醌衍生物，从而使自由基被清除；同时咖啡酸可以螯合金属离子，减少自由基的形成及其对脂质、蛋白质和DNA碱基的损伤[13]。因此，在明胶中引入咖啡酸，可赋予明胶优异的抗自由基氧化的能力。此外，咖啡酸的酚羟基可在漆酶作用下氧化形成半醌自由基或进一步形成醌，从而能够通过自由基偶联或醌与明胶中氨基/巯基的反应在明胶分子间形成化学交联[11]，因此共价导入明胶分子中的咖啡酸可以同时作为酶促交联明胶的活性位点。相较于使用戊二醛的化学交联方法，采用漆酶氧化交联水凝胶的方式具有良好的生物相容性，且易于实现细胞友好的原位交联，为改性明胶在组织工程中获得应用提供了优势。

体内不同组织基质硬度差异很大，细胞行为会受到细胞外基质硬度的影响[14]，而水凝胶降解性与基质重塑密切相关，进而可调节细胞间接触，调节干细胞命运[15]。因此，实现对水凝胶力学性质及降解速度的调控对其组织工程应用，特别是干细胞封装和递送具有重要的意义。明胶分子中咖啡酸接枝率的提高会增加水凝胶内部的交联密度，导致较高的弹性模量及较低的溶胀度[16]并减缓水凝胶的降解速度。此外，水凝胶中大量的咖啡酸可以通过氢键、π-π堆积和疏水相互作用与胶原酶结合，抑制胶原酶活性[17]，从而减缓水凝胶的降解速度。因此，通过改变咖啡酸的接枝率，可以方便的获得具有不同力学性质及降解速度的明胶水凝胶。但由于咖啡酸接枝过程会消耗明胶分子的部分氨基，使后续交联中可与醌反应的氨基减少，同时明胶中过量的咖啡酸会清除部分半醌自由基[7]，因此，咖啡酸接枝率的提高会使CA-gel的固化时间有所延长。

综上，本研究将咖啡酸接枝在明胶分子上，得到了具有不同接枝率的改性明胶；进一步使用漆酶氧化交联咖啡酸改性明胶，制备了具有可调节自由基清除能力、固化时间、弹性模量以及生物降解速率的水凝胶，该水凝胶具有良好的细胞相容性且在高氧化应激微环境中对成纤维细胞有显著的保护作用。