过表达miR-150的肾小管上皮细胞系HK-2中lncRNA的表达谱

郝相楠，栾军军，马 聪，张旖骁，周 华*

(中国医科大学附属盛京医院 1.肾内科； 2.泌尿外科， 辽宁 沈阳 110004)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一种由约22个核苷酸组成的短小，单链，非编码RNA[1]，几乎参与所有细胞进程，对于动物发育，细胞分化和体内平衡至关重要[2]。既往对miR-150的研究表明，miR-150的过表达显著降低了肾小管上皮细胞系HK-2中抗纤维化蛋白抑制因子细胞因子信号1(suppressor of cytokine signal 1, SOCS1)的表达并上调了促纤维蛋白的表达，促进了肾脏纤维化[3-4]。在HK-2细胞中，与巨噬细胞共培养增加了miR-150的表达，降低了SOCS1的表达[5]。以上充分证明miR-150在肾小管疾病中的重要作用和继续深入研究其相关效应的必要性。

长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，虽不编码任何蛋白质，但lncRNA可以通过顺式和反式作用机制和转录后调控来改变蛋白质编码基因的表达，包括印记和其他类型的转录调控、转录后调控，充当分子海绵等在基因表达的调控中起着重要作用[6]。微小RNA(miRNA)可以与其靶向mRNA相互作用以使mRNA被驱动降解[7]，lncRNA可以通过阻止miRNA与其靶向mRNA相互作用而抑制这些过程，从而促进mRNA稳定并诱导基因表达，逐渐成为mRNA稳定性和衰变的重要调节剂[8]。因此，lncRNA在自身免疫性疾病中发挥重要作用[9]。

本实验通过检测miR-150过表达的HK-2细胞中差异表达的lncRNA，筛选出与miR-150表达相关的lncRNA，探究miR-150能通过哪些lncRNA的表达从而产生效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人肾小管上皮细胞系HK-2(ATCC),复苏后接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的F12 培养液中，在含有5% CO2的37 ℃培养箱中培养至细胞增殖到80%汇合时进行传代，培养皿的接种浓度为1.0×105个/mL的细胞，待细胞贴壁后做相应处理。

1.1.2 试剂：胎牛血清、青链霉素、DMEM培养液、胰蛋白酶、非必需氨基酸、Lipofectamine 3000(Lipo3000)(Invitrogen公司); DMSO(Sigma-Aldrich公司); 反转录试剂盒和real-time PCR相关试剂 (TaKaRa公司); p-JAK2、JAK-2、p-STAT1、STAT1、p-STAT3、STAT3、COL-1、GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司); miR-150及内参引物序列由广州锐博生物科技公司设计并合成，miR-150上游引物5′-GGGTCTCCCAACCCTTGTA-3′，下游5′-ATCCAG TGCAGGGTCCGAGG-3′； 以U6为miR-150的测定内参，上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA AAT-3′，下游5′-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3′。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：转染之前按正常培养条件培养，细胞增殖汇合度至70%前1 h更换培养液，然后用250 μL无血清培养基稀释7.5 μL Lipo3000；再将Lipo3000稀释液与miR-150 mimic或阴性对照稀释液1∶1混合，室温孵育10 min；然后将250 μL转染液加入到加过培养基的3.5 cm培养皿中，在常规CO2培养箱中孵育48 h。

1.2.2 差异性lncRNA表达谱的鉴定：经过Illumina NovaSeq 6000测序仪测序，收获双端读长(reads)。利用Q30进行质控，使用cutadapt软件(v1.9.3)去除接头和低质量读长，获得高质量读长，分析lncRNA的结果。使用 hisat2软件(v2.1)，将高质量reads比对到人类参考基因组(UCSC HG19)上。然后，在gtf基因注释文件指导下，使用cuffdiff软件获得转录本水平lncRNA的FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)值，作为lncRNA的表达谱，并计算两个/组样品间的倍数变化和p-value 以筛选差异表达lncRNA。根据临近关系，预测lncRNA的靶基因，进行靶基因的GO和KEGG通路分析。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-150的相对表达量：用Trizol法提取HK-2细胞中总RNA，按照反转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，以cRNA为模板进行扩增，以U6作为内参，计算miR-150相对表达量(图4A)。

1.2.4 Western blot检测蛋白质表达：使用全蛋白质提取试剂盒提取蛋白质并且用BCA法测浓度。取出等量的蛋白质进行Western blot，首先进行SDS-PAGE并转膜。转膜结束后用5%脱脂奶粉室温于摇床封闭PVDF膜2 h，TBST洗净奶粉后加入一抗，4 ℃摇床过夜，回收一抗后用TBST洗净，将PVDF膜在室温下与二抗在室温摇床孵育1 h，再用TBST洗净二抗，使用Tanon 5500成像系统拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 过表达miR-150的HK-2细胞中lncRNAs的分布及特点

在miR-150组和阴性对照(normal control, NC)组中，lncRNA表达水平明显区分和聚类(图1A, B)。在HK-2细胞中共检测到97 286个lncRNAs转录本，其中miR-150组中表达下调的lncRNAs 25 858个，与NC组相比表达上调的lncRNAs 71 428个。LncRNA通过改变倍数和P值显示(倍数≥1.5且P<0.05)。362个lncRNAs在miR-150组和NC组中有显著差异表达，miR-150组细胞中有252个lncRNAs显著下调，110个lncRNAs显著上调，差异均为1.5倍以上(图1C)。在差异表达的lncRNAs中，大多数的长度在500～5 000个核苷酸(nucleotides，nt)(图1D)。这些差异表达的lncRNAs位于人类所有染色体上，包括22个常染色体和X染色体(X)。线粒体(M)上也分布着一些显著上调和下调的lncRNA(图1E)。在显著差异表达的362个lncRNAs中，46.1%(167/362)是外显子同义重叠的lncRNAs，3.8%(14/362)是内含子同义重叠的lncRNAs，4.1%(15/362)是内含子反义的lncRNAs，10.2%(37/362)是天然反义的lncRNAs，11.0%(40/362)是反向的lncRNAs，24.6%(89/362)是基因间的lncRNAs(图1F)。

2.2 差异表达lncRNAs的靶基因功能和通路富集

通过GO富集分析和KEGG通路富集分析来预测靶基因功能和途径。GO富集分析包括生物过程、细胞组分和分子功能3个部分(图2)。

KEGG富集分析显示,低表达lncRNA靶基因主要参与的信号通路包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性、麻疹、胰岛素抵抗、细胞凋亡、抗原处理和呈递、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂肪细胞因子信号通路(图3A)；高表达lncRNA靶基因主要参与的信号通路包括泛素介导的蛋白质水解、泛醌和其他萜醌生物合成、内质网中的蛋白质加工、p53信号通路、MAPK信号通路、GnRH信号通路、DNA复制(图3B)。

2.3 miR-150-lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1通路验证

miR-150模拟物转染HK-2细胞，HK-2细胞中miR-150的表达明显升高(图4A)，下调最显著的前5个lncRNAs为APOL6、UBL7、MVB12A、APOL1、NUDT14(图4B)，miR-150组的p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、COL-1表达均上调(图4C)。

3 讨论

微小RNA的失调可以导致生物学功能的改变，从而导致多种疾病的发生与发展[10]。既往研究表明，miR-150的过表达显著降低了肾小管上皮细胞系HK-2中SOCS1的表达并上调了促纤维蛋白的表达，促进了肾脏纤维化[3-4]。在HK-2细胞中，与巨噬细胞共培养增加了miR-150的表达，降低了SOCS1的表达[5]。以上充分证明miR-150在肾脏纤维化中的重要作用和继续深入研究其相关效应的必要性。但是关于miR-150能否调控lncRNA，目前尚无报道。

LncRNA虽不编码任何蛋白质，但在基因印迹、分化和发育、抗病毒反应等许多细胞过程中发挥着重要作用[6]。既往研究多数探究的是lncRNA对miR-150的影响，如lncRNA-HULC作为miR-150-5p的海绵，通过调节miR-150-5p对伊马替尼的抗性起到了促进作用[11]；在系统性青少年特发性关节炎中，lncRNA-MALAT1表达的下调通过JAK/STAT信号通路调节miR-150-5p/ZBTB4轴减少促炎细胞因子的产生[12]；LncRNA ZFAS1通过“海绵”作用于miR-150-5p，从而增加Notch3的表达[13]；LncRNA-PRLB的敲除部分地通过靶向miR-150-5p抑制RSF1/NF-κB信号的激活而提高卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性[14]；LncRNA-NEAT1通过miR-150-5p/CPSF4轴调节结直肠癌中5-氟尿嘧啶敏感性、细胞凋亡和侵袭[15]。而本研究探索了miR-150表达的改变对各种lncRNAs的表达产生影响，探求miR-150通过反向作用于lncRNA对肾脏生理病理过程可能发挥的作用。

A.each column represented kidney tissue, each row represented lncRNA identified by lncRNA sequencing, green represented down regulated lncRNA, and red represented up regulated lncRNA;B.volcano map showed the differential expression of lncRNA between miR-150 group and negative control group, the vertical line changes upward or downward by 2 times (log2 scaled); The horizontal line represented a P value of 0.05 (log10 scaled), the red dot showed that the differential expression of lncRNA was statistically significant; C.compared with the negative control group, there were 362 lncRNAs in miR-150 group, showing a significant difference of expression more than 1.5 times(P< 0.05),110 lncRNAs were up-regulated and 252 lncRNAs were down regulated; D.distribution of differentially expressed lncRNA based on the length of nucleic acid; E.distribution of differentially expressed lncRNAs based on the location of human chromosomes; F.distribution of differentially expressed lncRNAs based on the relationship between lncRNA and its coding genes

Through Gene Oncology (GO) analysis, the top 10 predictive functions of 252 low expression (A, C, E) and 110 high expression (B, D, F) lncRNAs regulated host genes in miR-150 group were obtained.They were classified according to biological processes (A, B), cellular components (C, D) and molecular functions (E, F)

通过测序发现，在miR-150过表达组中有362个显著差异表达的lncRNAs，提示miR-150可通过lncRNAs参与肾脏纤维化的发生，进一步在显著下调的lncRNAs中进行生物分析预测，发现lncRNA调节基因表达模式，驱动主要的细胞过程，而这些对于HK-2细胞/或肾脏的生理和病理过程至关重要。本研究主要对miR-150-lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1通路进行了探讨，发现miR-150的确能够通过lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1通路参与肾脏纤维化。

A.enrichment results of KEGG pathway with low expression of lncRNAs; B.enrichment results of KEGG pathway with high expression of lncRNAs

NC.normal control; A.transfection of HK-2 cells with miR-150 mimics; B.downregulation of the first five lncRNAs;C.Western blot of miR-150-lncRNA-JAK2-STAT1/3-COL1； *P<0.05 compared with NC group

综上，本研究通过对miR-150过表达和阴性对照的肾小管上皮细胞系HK-2进行测序分析，结果显示两组细胞中lncRNAs的表达存在显著差异；而其中受miR-150影响的部分lncRNAs可能参与各种生物过程及通路的调控。由于lncRNAs 具有较高的组织特异性，进一步分析这些lncRNAs或可为通过miR-150治疗各种肾小管疾病的研究及靶向治疗提供新思路。