COPD合并肺部感染患者中炎症因子表达与TLR2和TLR4表达相关性研究

戴举响，卢立国，严明月，赵 杰

(1.徐州医科大学第一临床医学院，江苏 徐州 221000；2.徐州医科大学第二附属医院，江苏 徐州 221000；3.徐州医科大学附属沭阳医院，江苏 沭阳 223600)

流行病学调查研究[1]显示：中老年人群中慢性阻塞性肺疾病(COPD)的总发病率约为9%，且呈逐年上升趋势，男性患者数明显高于女性.COPD患者多长期处于高粉尘等不良环境或有吸烟史，肺组织已出现明显损伤，增加了继发肺部感染的风险[2].COPD并发肺部感染的病情发展迅速，若未得到及时治疗会威胁患者生命安全，探讨其发病机制对改善临床预后具有重要意义.

Toll样受体是一类在固有免疫细胞表面表达的模式识别受体，配体激活后的Toll样受体能够大量分泌促炎因子，促进细胞炎症的级联放大效应，参与人体炎症反应和抗感染免疫过程[3].本研究探讨了Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)介导炎症信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)并发肺部感染的影响.

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年2月—2020年8月徐州医科大学第二附属医院收治的COPD患者240例.根据胸部CT、血常规、C反应蛋白、降钙素原以及临床症状评估患者并发肺部感染的严重程度，并将患者分为未感染组(98例)、轻度感染组(64例)、重度感染组(78例).未感染组中男58例，女40例；年龄42～75岁，平均(61.38±5.06)岁；病程3～8 a，平均(6.13±0.95)a.轻度感染组中男38例，女26例；年龄44～74岁，平均(61.95±5.72)岁；病程3～9 a，平均(6.41±1.03)a.重度感染组中男40例，女38例；年龄40～75岁，平均(61.13±5.38)岁；病程4～10 a，平均(6.65±1.21)a.另收集健康志愿者60例为健康对照组，其中男38例，女22例；年龄40～72岁，平均(60.85±4.62)岁.一般资料在各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性.本研究受试者均签署知情同意书.

入选标准：病情诊断符合《2013版慢性阻塞性肺疾病诊治指南》[4]中的标准；理解能力正常；临床资料完整.

排除标准：合并肺部肿瘤者；有自身免疫性疾病者；近3个月有影响免疫系统药物使用史者.

1.2 方 法

1.2.1 标本采集和单个核细胞分离

在COPD患者未使用抗菌药物前、健康对照组志愿者体检时，分别抽取静脉血5 mL，置入含乙二胺四乙酸的抗凝管中，取部分外周血标本3 000 r/min离心20 min，收集上清，-80 ℃保存待测.取另外一部分外周血标本，使用人外周血淋巴细胞分离液(深圳市达科为生物有限公司)分离单个核细胞，-80 ℃保存待测.

1.2.2 荧光定量PCR检测TLR2、TLR4的mRNA表达

采用TRIzol总RNA提取试剂盒(上海通蔚生物有限公司)分离单个核细胞RNA，全波长分光光度仪检测RNA浓度，反转录得到cDNA.荧光定量PCR检测TLR2、TLR4的 mRNA表达，引物序列由广州永诺生物有限公司设计、合成.TLR2引物：上游5′-GCCGCGTGTGGCCTGTACCGGC-3′，下游5′-TCGTCCAGCGGGTTGCTACCAA-3′；TLR4引物：上游5′-GGTAGTGTTACGGACACCATGAG-3′，下游5′- CCTCGTACAAGG TCCGCTATTCT-3′；GAPDH引物：上游5′-AAGAGGAGGTCGCGCCCGATCG-3′，下游5′-CTGACTGATGGAATTAGGCTAAC-3′.PCR反应条件：95 ℃ 2 min、95 ℃ 50 s、60 ℃ 30 s，共40个循环，72 ℃ 2 min.相对定量法测定TLR2、TLR4的mRNA表达水平.

1.2.3 Western blot检测TLR2、TLR4的蛋白表达

应用RIPA裂解液(上海贝博生物有限公司)提取各组单个核细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转至聚偏二氟乙烯膜，室温下封闭2 h，滴加1∶800稀释的鼠抗人TLR2单克隆抗体(北京奥维亚生物有限公司)、1∶500稀释的鼠抗人TLR4单克隆抗体(北京奥维亚生物有限公司)、1∶1 000稀释的兔抗人GAPDH单克隆抗体(北京奥维亚生物有限公司)，4 ℃过夜，滴加1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(北京奥维亚生物有限公司)；ECL显影，使用Image J软件读取各条带的灰度值.

1.2.4 血清炎症因子水平检测

取部分血清样本，用酶联免疫吸附法(试剂盒，上海酶远生物科技有限公司)检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-23(IL-23)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.

1.2.5 pDC和T细胞亚群水平检测

将部分外周血分装到上样试管中，每管100 μL.应用上流式细胞仪检测浆细胞样树突状细胞(pDC)、CD4+、CD8+水平，计算CD4+/CD8+比例，操作严格按试剂盒(北京博奥森生物有限公司)说明书进行.

1.2.6 IgG、IgM表达水平检测

取部分血清样本，免疫比浊法(检测试剂，苏州宇恒生物有限公司)检测免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)水平.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 各组外周血单个核细胞TLR2、TLR4的mRNA和蛋白表达水平

各组间TLR2、TLR4的mRNA和蛋白表达水平比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；轻度感染组、重度感染组TLR2、TLR4的mRNA和蛋白表达水平明显高于健康对照组、未感染组，差异具有统计学意义(P<0.05)；在未感染组与健康对照组之间TLR2、TLR4的mRNA和蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.

表1 各组外周血单个核细胞TLR2、TLR4的mRNA和蛋白表达水平Tab.1 TLR2 and TLR4 mRNA and protein expression levels of peripheral blood mononuclear cells in each group

1.健康对照组；2.未感染组；3.轻度感染组；4.重度感染组.

2.2 各组血清IL-1β、IL-17、IL-23、TNF-α水平

各组间血清IL-1β、IL-17、IL-23、TNF-α水平比较差异均具有统计学意义(P<0.01)；未感染组患者血清IL-1β、IL-17、IL-23、TNF-α水平明显高于健康对照组，轻度感染组明显高于未感染组和健康对照组，重度感染组明显高于轻度感染组、未感染组、健康对照组，差异具有统计学意义(P<0.05).见表2.

表2 各组血清IL-1β、IL-17、IL-23、TNF-α水平Tab.2 Serum IL-1β，IL-17，IL-23，TNF-α level of each group

2.3 各组pDC和T细胞亚群水平

各组间pDC、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例比较差异均具有统计学意义(P<0.01)；轻度感染组、重度感染组pDC、CD4+、CD4+/CD8+比例明显高于未感染组和健康对照组，CD8+明显低于未感染组和健康对照组，重度感染组pDC、CD4+、CD4+/CD8+比例明显高于轻度感染组，CD8+明显低于轻度感染组，差异具有统计学意义(P<0.05).见表3.

表3 各组pDC和T细胞亚群水平Tab.3 Levels of pDC and T cell subsets in each group

2.4 各组IgG、IgM水平

各组间IgG、IgM水平比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，轻度感染组、重度感染组IgG、IgM水平明显低于未感染组和健康对照组，重度感染组IgG、IgM水平明显低于轻度感染组，差异具有统计学意义(P<0.05)，未感染组与健康对照组IgG、IgM水平比较差异无统计学意义(P>0.05).见表4.

表4 各组IgA、IgG、IgM水平Tab.4 Levels of IgA，IgG and IgM in each group

2.5 外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达与各炎症因子的相关性分析

Pearson相关性分析显示：外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达水平与IL-17、IL-23、TNF-α、pDC、CD4+/CD8+呈正相关关系，与IgG、IgM呈负相关关系.见表5.

表5 外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达与各炎症因子的相关性分析Tab.5 Correlation analysis between expression of TLR2 and TLR4 in peripheral blood mononuclear cells and various inflammatory factors

3 讨 论

近年来的研究[5]发现：脂多糖诱导的重症急性胰腺炎大鼠中TLR4信号通路过度活化，胰腺腺泡细胞和免疫细胞大量分泌细胞因子，促使局部炎症反应进展为全身炎症反应.但Toll样受体介导的炎症级联反应在COPD并发肺部感染中作用的研究仍十分少见.不同Toll样受体识别的病原体存在结构差异，TLR2可在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等多种类型的细胞中表达，通过识别病原菌相关的内源性配体，引发信号传导和炎症介质的释放，在免疫防御系统激活中发挥重要作用[5-6].TLR4能够识别革兰阴性菌脂多糖，还能够识别坏死细胞释放的热休克蛋白，发挥天然免疫识别作用[7].本研究结果显示：轻度感染组、重度感染组TLR2、TLR4的mRNA和蛋白表达水平明显高于健康对照组、未感染组，提示COPD并发肺部感染患者TLR2、TLR4高表达，且能够反映感染的严重程度.

研究[8]发现：白细胞介素、中性粒细胞、TNF-α等炎症因子高表达参与COPD的发生与发展.肺部感染时炎性细胞趋化至肺组织，大量释放炎症因子，引发肺部持续性炎症，因此，炎症因子水平能够直接反映出肺部感染情况[9].本研究结果显示：血清IL-1β、IL-17、IL-23、TNF-α水平未感染组患者明显高于健康对照组，轻度感染组明显高于未感染组和健康对照组，重度感染组明显高于轻度感染组.Th17细胞及其分泌的细胞因子参与人体抗感染的早期免疫过程[10].相关研究[11]显示：肺炎链球菌所致的肺部感染患者肺泡灌洗液中IL-17、IL-23水平明显升高；呼吸道感染中Th17细胞能够通过分泌IL-17来活化气道中性粒细胞，参与炎症反应过程[12].肺炎克雷伯菌感染过程中IL-17能够调控趋化因子表达影响下游Th1型细胞和其分泌的IL-1β等细胞因子水平，诱发局部炎症反应[13].本研究结果提示：COPD患者中存在炎症因子高表达，且与并发肺部感染的严重程度密切相关.

Th17细胞由CD4+T细胞分化而来，CD4+T细胞在人体免疫系统中发挥中枢作用，能够抑制多种感染，对抗入侵人体的病原菌[14].CD8+是部分T细胞表面的一种糖蛋白，表达CD8+的T细胞活化后能够分化成具有细胞毒性的T细胞、特异性杀伤靶细胞[15].CD4+/CD8+比值能够反映人体免疫系统功能水平，与感染程度相关[16].本研究结果显示：pDC是树突状细胞亚群之一，能够分泌Ⅰ型干扰素，是先天免疫反应和适应性免疫反应的连接桥梁.本研究结果显示：COPD并发肺部感染患者pDC、CD4+、CD4+/CD8+比例明显升高，CD8+明显降低；重度感染患者上述改变较轻度感染患者更明显.IgG是免疫球蛋白G，占人体血液中抗体总量的75%左右，其在人体免疫中发挥保护作用，可以预防病原菌所致的感染性疾病[17].

IgM是人体发育中最早产生的抗体，当发生感染时会快速产生，进而抑制病原菌感染[18-19].本研究结果显示：COPD并发肺部感染患者IgG、IgM水平明显降低，重度感染患者IgG、IgM水平明显低于轻度感染患者.相关性分析显示：COPD患者外周血单个核细胞TLR2和TLR4表达水平与IL-17、IL-23、TNF-α、pDC、CD4+/CD8+呈正相关关系，与IgG、IgM呈负相关关系.提示COPD并发肺部感染患者TLR2和TLR4表达上调能够刺激pDC细胞，提升其抗原呈递能力，加速促炎细胞因子分泌，同时还能够促进CD4+细胞增殖，激活人体免疫反应.但TLR2和TLR4激活是把“双刃剑”，促炎因子过表达会加剧局部炎症反应，CD4+/CD8+平衡失调和免疫球蛋白水平下降会减弱人体免疫功能，加重气道慢性炎症反应，促进COPD病情发展和肺部感染的加剧，导致预后不良.