北五味子根叶多糖对小鼠镇静催眠作用研究

SUHAYB Mahamed Farah，陈红旭，苑丽葳，刘佳乐，孙靖辉，王春梅，张成义，陈建光，李 贺

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心医院，吉林 吉林 132011)

睡眠是人类必不可少的一种生理现象，人们的睡眠时间约占生命活动总时间的三分之一[1].研究[2]表明：高质量的睡眠不仅能保护和恢复脑细胞的功能，还能够增强自身免疫.目前，世界范围内约有27%的人群正在被失眠所困扰[3]，长期失眠不仅会影响人的工作效率，而且对身心健康不利[4].临床上治疗失眠的药物以化学合成类为主，长期使用会产生明显的依赖性、呼吸抑制等副作用[5].自古以来有大量的中药材被认为具有镇静催眠、养身安神的功效，并且毒副作用小，安全指数高，具有较好的研究和开发应用前景[6].

五味子作为传统的中药材，在《神农本草经》等大量古籍中都有记载，其具有丰富的木脂素以及多糖成分[7].本团队近年的研究[8-12]表明：五味子的有效成分具有降血脂、抗疲劳、抗氧化、抗肝损伤、镇静催眠等功效.吉林省是五味子的重要产区，五味子的果实需求量较大，其根、叶在前期研究发现也含有多糖、木脂素等有效成分，因此，应该对其非药用部位展开深入研究并加以利用[13].本实验选用吉林省集安市优质北五味子，为有效开发利用资源，我们提取了五味子根及叶的多糖成分，观察其对小鼠镇静催眠及抗焦虑作用的影响，以期为五味子的全面开发及镇静催眠、抗焦虑药物的开发提供理论依据.

1 材料与仪器

1.1 材 料

地西泮(山东信谊制药有限公司)；羧甲基纤维素钠、戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamate，Glu)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；北五味子根、叶粗多糖(北华大学五味子开发及产业化工程研究中心提供).

1.2 动 物

ICR小鼠(长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2020-0001)，体质量(20±2)g，雄性，分笼饲养，自由饮水、饮食，室温20～25 ℃，适应性喂养7 d后进行实验.

1.3 仪 器

ZZ-6小鼠自主活动测试仪、PMT-100高架十字迷宫(成都泰盟科技有限公司)；手持组织匀浆机(上海净信实业发展有限公司)；大容量高速离心机(Eppendorf生命科学公司，德国)；全自动酶标仪(Tecan公司，瑞士).

2 实验方法

2.1 动物分组

将120只ICR小鼠随机平均分组，分别为空白对照组(CON，蒸馏水灌胃)、根多糖组(SRP，含量23.6 mg/g，给药剂量为152 mg/kg)、叶多糖组(SLP，含量19.7 mg/g，给药剂量为189 mg/kg)、地西泮阳性对照组(DAP，行为学实验前以4 mg/kg灌胃).小鼠适应性喂养1周后灌胃1次/d.

2.2 SRP、SLP对小鼠自主活动的影响

每组取前10号小鼠于灌胃30～40 min后进行实验，记录小鼠5 min内站立以及活动次数，每组实验结束后喷洒酒精除去气味后方可进行下一组实验.

2.3 SRP、SLP对小鼠高架十字迷宫行为学的影响

选取进行过自主活动后的小鼠进行实验.将小鼠(灌胃30～40 min后)置于空旷区域中活动5 min，再将小鼠置于迷宫中心，记录小鼠进入开臂和闭臂区域的次数(开臂次数/在臂次数比例(OE)，在臂次数=开臂次数+闭臂次数)和时间(开臂滞留时间/在臂滞留时间比例(OT)，在臂时间=开臂滞留时间+闭臂滞留时间)，并进行数据分析(5 min内数据).在实验完成后需喷洒酒精以清除气味.

2.4 SRP、SLP对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠的影响

选取进行过行为学实验的小鼠，腹腔注射阈下剂量的戊巴比妥钠(37.5 mg/kg)，记录翻正反射消失60 s以上的小鼠数量(30 min内)；每组10～20号小鼠在给药40 min后，腹腔内给予阈值剂量的戊巴比妥钠(49.5 mg/kg).记录睡眠时间和觉醒时间.

2.5 小鼠脑组织中GABA、Glu含量测定

在末次给药40 min后，断颈处死每组20～30号小鼠，置于装满冰块的烧杯中迅速取下大脑，用4 ℃生理盐水洗净并擦干称重，高速匀浆并分离上清(4倍加入生理盐水，4 ℃，离心10 min，3 000 r/min)，实验按照试剂盒说明书进行操作.

2.6 统计学分析

3 结 果

3.1 SRP、SLP对小鼠自主活动的影响

本研究结果显示：与CON比较，SRP组及DAP组小鼠站立次数明显减少(P<0.01)，SLP组小鼠站立次数差异无统计学意义(P>0.05)，SRP组与SLP组比较差异具有统计学意义(P<0.01).SRP组、SLP组及DAP组小鼠活动次数均明显减少(P<0.01)，且SRP组与SLP组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，提示SRP和SLP具有镇静作用.见图1 a、b.

*.与CON组比较P<0.05；**.与CON组比较P<0.01；##.与SLP组比较P<0.01.图1SRP、SLP对小鼠自主活动的影响Fig.1Effect of SRP and SLP on autonomous activities of

3.2 SRP、SLP对小鼠高架十字迷宫行为学的影响

本研究结果显示：与CON组比较，SRP组、SLP组及DAP组小鼠开臂次数/在臂次数比例(OE)均明显升高(P<0.01)；SRP组、SLP组及DAP组小鼠开臂滞留时间/在臂滞留时间比例(OT)均明显升高(P<0.01)，提示SRP、SLP可能具有抗焦虑作用.见图2 a、b.

**.与CON组比较P<0.01.图2SRP、SLP对高架十字迷宫小鼠的影响Fig.2Effect of SRP and SLP on elevated plus maze

3.3 SRP、SLP对戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响

戊巴比妥钠阈下剂量协同睡眠实验结果显示：CON组、SRP组、SLP组、DAP组睡眠只数分别为1、6、2、10只.睡眠率分别为10%、60%、20%、100%.

戊巴比妥钠阈剂量协同睡眠实验结果显示：在睡眠潜伏期的比较中，与CON组比较，SRP组和DAP组小鼠睡眠潜伏期极显著减少(P<0.01)，SRP组与SLP组比较差异具有统计学意义(P<0.01).见图3 a.与空白对照组比较，SRP组、SLP组及DAP组小鼠睡眠时间均明显增加(P<0.01)；与SLP组比较，SRP组睡眠时间均明显增加(P<0.05，P<0.01)，提示SRP、SLP可能具有催眠功效.结果见图3 b.

**.与CON组比较P<0.01；#.与SLP组比较P<0.05；##.与SLP组比较P<0.01.图3SRP、SLP对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期的影响Fig.3Effects of SRP and SLP on the sleep latency of mice induced by threshold-dose pentobarbital

3.4 SRP、SLP对小鼠脑组织中GABA、Glu含量的影响

在GABA的检测中，SLP组与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05)，SRP组与空白组、SLP组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；在Glu的检测中，SRP组、SLP组与CON组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，并且SRP组与SLP组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；在GABA/Glu的影响研究中，SRP组、SLP组与CON组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，SRP组和SCP组比较差异具有统计学意义(P<0.01).提示SRP、SLP均可能通过调控GABA、Glu的含量来达到镇静催眠效果的.见图4 a、b、c.

*.与CON组比较P<0.05；**.与CON组比较P<0.01；##.与SLP组比较P<0.01.图4SRP、SLP对小鼠脑组织中GABA、Glu含量的影响Fig.4Effects of SRP and SLP on the content of GABA and Glu in the brain tissue of

4 讨 论

长期失眠会使人工作效率变低，身心健康受到影响.失眠一般分为原发性失眠和继发性失眠两种，原发性失眠是经过多重筛查后，仍不能明确是何因素导致的失眠；继发性失眠大多是由精神压力、身体疾病、药物等多种因素所导致的，由于其发病机制复杂，导致无法对症下药.目前临床上治疗失眠以化学合成类药物为主，巴比妥类虽具有良好的镇静催眠效果，但其长期使用有明显的依赖性、呼吸抑制等副作用[14]；苯二氮卓类毒性较小，安全范围大，长期使用会产生耐受性，停药会有戒断症状；非苯二氮卓类药物虽优于上一代，但也会产生不良反应[15].自古以来，我国有大量的中药材被认为具有镇静催眠、养身安神的功效，毒副作用小，安全指数高，具有较好的研究和开发应用前景[16].因此，寻找既安全又有效的镇静催眠药物具有重要意义.

自主活动实验是测试小鼠中枢神经系统兴奋状态的经典实验之一，站立的次数和活动的次数越高，则代表小鼠神经系统兴奋性越强[17].一般认为小鼠开臂/在臂滞留时间百分率和开臂/在臂进入次数百分率越小，焦虑程度越严重[18].戊巴比妥钠诱导睡眠实验是检测催眠药物影响小鼠睡眠状况的经典实验，阈下剂量睡眠只数越多，睡眠潜伏期越短，阈剂量睡眠时间越长，则代表药物的催眠效果越好[19].本实验结果提示SRP、SLP具有一定的镇静催眠及抗焦虑作用.

在本课题组前期研究[12]中发现，五味子果木脂素发挥中枢抑制作用可能与其减少脑中兴奋性神经递质有关.为了初步探讨SRP、SLP发挥镇静催眠药效的机制，本实验采用ELISA试剂盒检测小鼠脑部的GABA、Glu含量，并计算GABA/Glu值.Glu和GABA是中枢神经系统(CNS)中十分重要的氨基酸，GABA作为最重要的抑制性神经递质之一，在缺乏时会产生焦虑情绪[20].目前，常用巴比妥类催眠药物就是通过增加GABA的神经功能、促进脑内GABA释放从而发挥作用，而Glu是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质[21]，可脱羧形成GABA，两者与睡眠高度相关[22].本研究结果表明：SRP能增加脑内GABA的含量，SRP、SLP均可显著降低Glu含量，并且SRP、SLP 可增加GABA/Glu比值，提示SRP可能是通过增加抑制性递质GABA合成、减少兴奋性递质Glu的代谢而起到中枢抑制作用的.值得一提的是，SLP虽然降低了Glu含量，但是却没有显著升高GABA的含量，提示SLP可能是通过增加GABA合成量或者减少代谢量而维持其含量，具体调节GABA含量的方式以及相关镇静催眠作用机制还需进一步探讨.

综上所述，北五味子的根、叶多糖均具有镇静催眠及抗焦虑作用，本研究可为五味子资源的合理应用及镇静催眠抗焦虑中药的开发提供理论依据.