超高效液相色谱-串联质谱法快速检测麦类中典型链格孢霉毒素

吴 希，邢家溧，郑睿行，张爱芝，毛玲燕，徐晓蓉，娄永江，穆应花

（1.宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315211；2.宁波市产品食品质量检验研究院（宁波市纤维检验所），浙江 宁波 315048）

链格孢霉毒素（toxins，ATs）是链格孢霉菌产生的次级代谢物，最为典型的有链格孢酚（alternariol，AOH）、交链格孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、交链孢烯（altenuene，ALT）、细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、交链孢毒素I（altertoxin I，ATX-I）、腾毒素（tentoxin，Ten）和细格菌素（altenusin，ALS）。这些毒素在自然界中广泛存在，会侵染谷物导致作物减产，还能污染后续的加工产品造成经济损失。ATs具有急慢性毒性以及三致效应（致癌、致畸、致突变），对人体健康构成严重威胁。

麦类作物易受ATs污染，Siegel等在荞麦粉中检出TeA含量高达851 μg/kg；何玲等在调查四川省市售小麦及其制品中ATs污染情况时，在小麦及其制品检出AOH、AME、TeA和Ten含量分别为0.75、0.57、27.2 μg/kg和4.78 μg/kg；Asam等在调查婴儿谷物产品中的ATs污染情况时，在小麦、燕麦、黑麦产品中检出TeA含量为8～30 μg/kg。随着ATs危害逐渐明晰，人们的风险防范意识也逐步加强，但因缺乏准确的检测分析方法和系统性的风险评估数据，鲜见ATs的相关法规与限量标准，目前我国仅有1 项ATs的行业标准，但应用范围只限于部分果蔬。因此，要尽快建立简单、快速、高效、灵敏的ATs检测方法，推动我国麦类中ATs残留水平的控制、检测标准的制定和管理措施的采取。

目前，ATs的主要检测技术有薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）法、酶联免疫检测（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法、气相色谱（gas chromatography，GC）和气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法等。TLC与ELISA法操作繁琐且灵敏度低，ATs稳定性好而挥发性差在GC和GC-MS/MS检测方法中受到限制。UPLC-MS/MS具有高灵敏度及高选择性等优点，近年来对ATs的分析主要集中在UPLC-MS/MS的研究和应用方面。但目前麦类中ATs的研究大多集中于单一或几种毒素的检测，如Siegel等利用UPLC-MS/MS检测荞麦粉中TeA，检出限为10 μg/kg；何玲等利用HPLC结合荧光检测器同时检测小麦中的AOH、AME、TeA、Ten毒素，检出限为0.2～1.0 μg/kg；Asam等用UPLC-MS/MS法测定小麦、燕麦、黑麦中的TeA，检出限为1 μg/kg。另外，为了进一步提高检测效果，目前报道了多种ATs的提取和富集方法，包括QuEChERS法和固相萃取方法。但这些方法虽然前处理简单，灵敏度高，但检出限高，只能同时检测少数几种ATs。

基于以上研究现状，本研究拟采用具有操作简单、富集倍数高、有机溶剂用量少、成本低廉等优点的分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）方法，快速富集和净化麦类中7种ATs，再结合UPLC-MS/MS技术，实现麦类中7种ATs的快速定性和定量测定。这将为麦类中ATs的污染状况研究提供方法依据，也为我国食品中ATs限量标准的制定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麦类样品购于当地超市，磨碎（500 r/min，5 min），过筛（40 目），于0 ℃条件下保存。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷（均为色谱纯） 美国Sigma公司；无水硫酸镁、氯化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；毒素标准品：AOH、AME、ALT、TeA、ATX-I、Ten和ALS（纯度均≥98%） 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Xevo TQ-XS三重四极杆质谱仪、BEH C色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美国Waters公司；X1R高速离心机 美国赛默飞世尔科技公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；TurboVap® LV多功能全自动样品浓缩仪 上海Biotage有限公司；Milli-Q型超纯水机（电阻率为18.2 MΩ·cm）美国Millipore公司；IKA-Vortexd2旋涡混合器 德国IKA（艾卡）仪器设备有限公司；Multi Reax-Heidolph多管漩涡振荡器 德国海道夫仪器设备有限公司；ME-204电子分析天平（精度为0.000 1 g） 梅特勒-托利多仪器有限公司；KS-300EI超声波清洗机 宁波科生设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

标准储备液：分别准确称取AOH、AME、ALT、TeA、ATX-I、Ten和ALS标准品0.001 g（精确至0.000 1 g）溶于10 mL乙腈中，配制成质量浓度为100 mg/L的标准混合液，取100 μL标准混合液（100 mg/L），并用乙腈溶解定容至10 mL棕色进样瓶中，得到质量浓度为1 mg/L的标准储备液，密封后置于-20 ℃保存、备用。

标准工作液：用乙腈-水（1∶1，/）将标准储备液逐级配制成质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的7种ATs的混合标准溶液。

基质标准工作液：用空白基质溶液逐渐稀释1 mg/L的混合标准储备液，制备成10 μg/L的基质标准工作液。

1.3.2 提取和净化

准确称取1 g样品（精确至0.01 g），置于50 mL的螺口尖底离心管中，加入3 mL一级水、10 mL1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取剂，涡旋3 min。加入2 g无水MgSO、1 g NaCl在40 ℃下超声5 min、振荡提取15 min，9 500 r/min、4 ℃离心10 min，取1 mL上清液。

加入100 μL三氯甲烷萃取剂、5 mL的1.5 g/L氯化钠溶液、0.4%甲酸溶液（/），4 500 r/min离心5 min，取下清液，氮吹浓缩至干，用甲醇溶液复溶至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 分析条件

BEH C色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温为40 ℃；流动相：A为0.1%甲酸溶液（/），B为乙腈；流速0.40 mL/min；进样体积5 μL；梯度洗脱程序：0～5.0 min，90%～5% A、10%～95% B；5.0～7.0 min，5% A、95% B；7.0～7.5 min，5%～90% A、95%～10% B；7.5～10.0 min，90% A、10% B。

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），正负离子模式扫描；毛细管电压1.08 kV；锥孔电压25 V；射频透镜1和射频透镜2的电压均为15.0 V；离子源温度150 ℃；脱溶剂温度600 ℃；脱溶剂气流量1 000 L/h；锥孔反吹气流量150 L/h；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。7种ATs的保留时间和质谱参数见表1。

表1 MRM模式下7种ATs的保留时间和质谱测定参数Table 1 Retention time and mass spectral parameters for the seven ATs in MRM mode

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

取7种目标物的混合标准溶液（100 μg/L），分别以自动进样的方式在全扫检测模式下进行质谱条件优化。结果显示ATX-I在ESI模式扫描下不成峰，而在ESI模式扫描时响应值较高（图1），且峰形尖锐，剩下6种ATs在ESI模式得到的离子峰的响应值更佳。通过子离子扫描得到目标物碎片化离子信息，选择最强的产物离子和次强的产物离子分别作为7种ATs的定性和定量离子，并对锥孔电压、碰撞电压、离子源温度、脱溶剂气体温度、碰撞气体流量质谱参数进行优化。实验优化的质谱条件，使每种靶物质得到最佳电离效率（表1）。

图1ATX-I毒素的离子对质谱图Fig. 1 Ion pair mass spectra of ATX-I

2.1.2 色谱条件的优化

分别选择纯水-乙腈和0.1%甲酸-乙腈溶液（/）作为流动相，比较2个流动相体系对分离效果的影响。结果发现，在纯水流动相中TeA毒素会出现拖尾现象，而纯水加入0.1%甲酸溶液（/）有利于抑制真菌毒素与色谱柱的静电作用，避免拖尾现象，TeA毒素峰形对称性明显得到改善。因此本实验最终选择0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相。

取质量浓度为100 μg/L的7种目标物混合标准溶液，以0.1%甲酸-乙腈溶液作为流动相，按表1进行梯度洗脱，在保持浓度、流速、进样量等参数一致的条件下，考察HSS T（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）和BEH C（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）这2种色谱柱对7种ATs的分离效果以及每种毒素的峰形、保留时间。结果显示BEH C分离效果优于HSS T，7种ATs在BEH C柱上能获得更好的峰形和检测灵敏度，且BEH C具有广谱性、次级相互作用较低，pH值耐受范围宽（pH 1～12），柱效更高，峰形尖锐等优点，故选择BEH C作为分析柱。

同时对流速、柱温及梯度洗脱程序进行优化，确定流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃；由于7种ATs具有不同的极性，ALT的极性较强，AME的极性较弱，为了兼顾7种ATs能同时出现良好峰形，需要对流动相进行较大的梯度变化，通过不断调整，确定的洗脱程序见1.3.3节。在最优条件下得到的7种ATs色谱图见图2，可以看出7种ATs在5 min内可较好分离。

图2 优化条件下6种ATs的正离子图（A）和ATX-I的负离子图（B）Fig. 2 Positive ion chromatograms of six ATs (A) and negative ion chromatogram of ATX-I under the optimized conditions (B)

2.2 提取液的优化

ATs易溶于甲醇与乙腈，其中TeA的酸性和极性较强，需在提取剂中加入适量的酸，1.5%甲酸最有利于TeA的提取。研究比较1.5%甲酸-乙腈（/）、1.5%甲酸乙腈-甲醇的不同比例对7种ATs提取效果的影响，结果表明，添加甲醇对ATX-I的提取效果影响明显，对比1.5%甲酸-乙腈（/）提取体系，ATX-I的回收率在1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）体系中提升10%，这也与畅彤等研究适量的甲醇有利于ATX-I提取一致；甲酸的添加有利于TeA的提取，在1.5%甲酸-乙腈（/）提取体系中回收率高达92%；1.5%甲酸乙腈-甲醇比例从1∶4到4∶1，小麦样品的提取液颜色由深黄色变为浅黄色，猜测色素这一干扰物对实验的干扰在减小。1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取体系中7种ATs的回收率最佳，在78.7%～100%之间（图3），故选择1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取体系。

图3 提取溶剂体系对小麦样品中7种ATs回收率的影响（n=5）Fig. 3 Effect of extraction solvent systems on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.3 萃取条件的优化

2.3.1 萃取剂的优化

小麦样品经提取、盐析分层后，蛋白质、油脂、色素以及糖组分等会被萃取出来，为减小杂质的影响，对萃取条件进行考察。以1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取液作为分散剂，分别考察乙酸乙酯、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷作为萃取剂时对各目标组分的萃取效率，以7种ATs含量计算回收率。使用乙酸乙酯作为萃取试剂时没有观察到沉积相，因此不适合作为萃取试剂。使用其他3种萃取剂所得回收率见图4，三氯甲烷回收率（83.1%～94%）比氯苯（75.1%～88.7%）和二氯甲烷（62.7%～72.7%）较优，当以三氯甲烷作为萃取剂时，各个目标物质的萃取效率较好，对目标组分无干扰，且三氯甲烷在水中的溶解度较小，可以减少萃取剂的损失，故选择三氯甲烷作为本实验的萃取溶剂。

图4 萃取剂种类对7种ATs回收率的影响（n=5）Fig. 4 Effect of extractant type on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.3.2 萃取体积的优化

由于使用三氯甲烷溶剂进行DLLME时，小麦样品基质中某些成分会沉淀在离心管底部，影响萃取试剂的吸取。因此，使用更大体积的萃取试剂可以更方便吸取离心后的萃取试剂。在分散剂体积为1 mL的条件下，分别用50、100、150 μL的三氯甲烷进行萃取，考察不同体积萃取剂对萃取回收率的影响。结果如图5所示，随着三氯甲烷体积增大，回收率也增大，而当体积大于100 μL时，回收率增加不明显，而且三氯甲烷的使用体积越大，实验更耗时，最终萃取剂中三氯甲烷的占比也越大，对于含有甲酸的流动相体系，容易造成溶剂效应，使峰形变差。因此，最终确定三氯甲烷100 μL为最佳萃取体积。

图5 萃取剂体积对7种ATs回收率的影响（n=5）Fig. 5 Effect of extractant volume on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围、检出限、定量限

以乙腈为溶剂，配制7种ATs系列混合标准溶液直接进样分析。以质量浓度为横坐标（，μg/L），以峰面积为纵坐标（，AU），绘制目标分析物的基质加标校正曲线（表2）。结果显示，7种ATs在各自范围内均能获得良好的线性关系，均大于0.987 277，以信噪比3和信噪比10确定方法的检出限和定量限。7种ATs的检出限和定量限分别为0.11～0.16 μg/kg和0.42～0.49 μg/kg。

表2 7种ATs的线性范围、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, detection limits, and quantification limits of seven ATs

2.4.2 加标回收率以及精密度

按1.3.2节处理小麦样品，分别以1、2 倍和10 倍定量限进行三水平加标实验。每个水平在1 d内重复测定5 次，计算平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。如表3所示，7种ATs的平均加标回收率为70.7%～101.3%，RSD为1.22%～4.11%，均小于10%，说明该方法性能良好。本方法对小麦样品的不同含量的7种ATs均具有较高的回收率和精密度，满足检测要求。

表3 7种ATs在小麦样品中的加标回收率和精密度（n= 5）Table 3 Recoveries and precision of seven ATs spiked in wheat samples (n = 5)

2.4.3 基质效应

取质量浓度为10 μg/L的7种目标物混合标准溶液，比较基质提取液和纯溶剂中7种ATs响应值，以评估基质效应（matrix effect，ME）。ME＜85%或ME＞115%，存在基质抑制或增强作用，85%≤ME≤115%，基质对分析物的分析过程无显著的干扰。

如表4所示，小麦样品中7种ATs的ME在90.7%～115%之间，基质对分析物的分析过程无显著干扰，保证了检测结果的准确度与可靠性。

表4 7种ATs在小麦样品基质的ME（n=5）Table 4 Matrix effect of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.4.4 与其他方法比较

如表5所示，本研究与QuEChERS方法相比回收率高，比固相萃取处理步骤简单、试剂用量少、成本低廉等，且本研究涉及的ATs种类广、数量多，结合UPLC-MS/MS具有检测灵敏度高、抗干扰能力强、定性准确等优点，能用于麦类样品中7种ATs的快速（5 min内）定性、定量分析测定。

表5 本实验方法与其他文献方法的比较Table 5 Comparison of the UPLC-MS/MS method and other existing methods present in the literature

2.4.5 实际样品测定

使用本实验建立的方法对市购黑麦、荞麦、莜麦、青稞、燕麦、小麦6种麦类样品（各20个）进行7种ATs的检测分析，结果见表6。结果显示这6种麦类中7种ATs均有不同程度的检出，黑麦样品检出Ten、AOH、ALT、TeA、ALS；荞麦样品中检出Ten、ALT、TeA、ALS、ATX-I；莜麦样品中检出7种ATs；青稞样品中检出Ten、ALT、TeA、ALS、ATX-I；燕麦样品中检出Ten、AOH、TeA、ALS、ATX-I；小麦样品中检出Ten、AOH、AME、ALT、TeA、ALS。Ten和TeA是6种麦类中都检出的毒素，含量分别是0.6～10.7 μg/kg和未检出～31 μg/kg；ALS虽检出率低于Ten和TeA，但最高含量37.3 μg/kg与TeA相当。实际样品测定结果表明Ten、TeA广泛存在于麦类中，这一研究结果与之前研究报道的结果基本一致。

表6 麦类样品中7种ATs的含量统计Table 6 Statistical analysis of results obtained for the determination of seven ATs in rye, buckwheat, naked oat, barley, oat, and wheat

续表6

3 结 论

采用DLLME前处理结合UPLC-MS/MS同时检测麦类中7种ATs的分析方法。该方法具有操作简单、快速（7种ATs在5 min内完成色谱分离分析）、回收率高、灵敏度高、检出限低等优点，能满足麦类中真菌毒素的检测要求，具有实际应用价值。将该方法应用于麦类样品中的实际测定，结果显示Ten和TeA是6种麦类中都检出的毒素，含量分别为0.6～10.7 μg/kg和未检出～31 μg/kg；ALS虽检出率低于Ten和TeA，但最高含量37.3 μg/kg与TeA相当，这些结果将为粮食中ATs残留水平的控制、检测标准的制定和管理措施的采取，都具有重要的理论和现实意义。