电子鼻同步检测花生霉菌及霉菌毒素

王 蓓，沈 飞,*，何学明，蒋雪松，袁 建，方 勇，胡秋辉，邱伟芬，MAMO Firew Tafesse

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京林业大学机械电子工程学院，江苏 南京 210037；3.巴赫达尔大学生物技术研究所，埃塞俄比亚 亚的斯亚贝巴 5954）

花生是世界各地重要的农产品，中国是世界上最大的花生生产国，在满足人们对油脂和蛋白质的需求方面起着至关重要的作用。然而，作为蛋白质、热量、维生素和矿物质的良好来源，由于贮藏条件不佳，运输条件不当，花生容易受到腐败菌或产毒真菌的污染，其中最常见的是曲霉属。黄曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）的污染是影响食品安全和质量的重要问题，对花生种植区造成了严重的经济损失。此外，它也是导致肝癌的一个重要原因，被国际癌症研究机构列为I类致癌物。我国GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》规定花生中AFB含量不超过20 μg/kg。

食品中黄曲霉毒素的常规检测方法有微生物鉴定法、色谱法、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、分子鉴定技术或聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等。然而这些技术均较为繁琐、检测时间长、成本高，难以满足现场大规模筛查的需求。因此，开发快速、无损的毒素检测方法具有重要意义。花生腐败霉变是一个复杂的过程，微生物在消耗大量营养物质同时气味也发生了变化。而电子鼻可以有效检测源自于微生物代谢的有害食物异味，在真菌毒素污染状况预测方面具有突出优势。迄今为止，电子鼻技术在水果、蔬菜、粮食、禽类等农产品品质检测领域得到广泛应用。有学者已经对糙米、小麦、稻谷、玉米等的霉变情况进行了检测研究，并在糙米、玉米、大麦及小麦霉菌毒素快速分析方面展开了一定应用。在花生方面，叶蔺霜利用电子鼻技术研究花生品质，区分相同贮藏时间的破壳花生与完好花生及新鲜花生与陈旧花生。刘鹏利用电子鼻有效区分受霉菌污染不同程度的花生样品。林茂等利用电子鼻对烘烤样品进行分析，能够较好地区分生品、烤箱烘烤和微波烘烤样品。

由上可知，前人对粮食霉变程度与真菌毒素分别进行检测研究已有相关报道，但利用电子鼻技术同时检测霉菌霉变程度及毒素含量的报道较少。因此，本研究拟以接种不同的产毒和非产毒菌株的花生样品为研究对象，检测其在不同贮藏时期（0～6 d）的电子鼻信号，建立花生受不同霉菌感染下的霉变程度及毒素含量的同步快速判别模型，以期为花生贮藏时期的安全提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

花生样品取自南京当地超市。采用Ravindran等的方法对样品进行彻底灭菌，经Co、剂量为12 kGy的辐照后，放置于无菌塑料袋中，在接种前保存于4 ℃。

从北纳创联生物技术研究所购买5 株花生中常见的真菌菌株（黑曲霉（）186380、黄曲霉（）142801、黄曲霉185860、黄曲霉185691、寄生曲霉（）335939）。所有菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基于26 ℃和相对湿度80%条件下培养7 d，产生大量孢子。培养结束后，加入无菌蒸馏水，用无菌接种环从培养基表面分离得到孢子。真菌孢子浓度按GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》中平板计数法测定，加入无菌水调节最终浓度约为1×10CFU/mL。

1.2 仪器与设备

Fox-3000型电子鼻 法国Alpha MOS公司；AFBELISA试剂盒 北京华安麦科生物技术有限公司；SpectraMax M2E多功能酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

将灭菌后样品随机分为6组（每组35 份，每份50 g花生），其中5组为实验组且每个实验组接种一株，另外1组为空白组。在无菌条件下，将5 株菌株的1 mL真菌悬浮液分别接种35 份样品，共175 份样品中。另外空白组（35 份样品）只添加1 mL无菌水。所有样品均置于210个无菌塑料盒中，在培养箱（26 ℃和相对湿度80% ）中培养6 d，以促进真菌的生长。接种后每天采集30 份样品（5 份样品×5个菌株+5个空白样品）进行电子鼻测量分析，直至第6天。用标准平板计数法（GB/T 4789.2—2016）测定样品的菌落总数，结果用重复3 次实验的平均值（lg（CFU/g））表示。采用ELISA法测定样品中AFB的含量（GB/T 5009.22—2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》）。

1.3.2 电子鼻信号测量

电子鼻数据采集实验使用FOX 3000电子鼻设备，它包含对挥发性化合物不同灵敏度和选择性的12个气体传感器。该系统由3 部分组成：采样装置、传感器阵列组成的探测器单元和数据记录和分析的模式识别软件。电子鼻的工作原理是基于人鼻的工作原理，通过模拟鼻内嗅细胞的传感器阵列分析样品的挥发性成分，然后这些信号被发送到模拟大脑功能的数据识别系统。传感器阵列会产生一种特殊的气味轮廓，称为指纹图谱，以响应挥发性分子与样品的相互作用，通过将获得的气味轮廓与简单的气味标准进行比较识别混合物成分。指纹图谱的变化可能是由于新化合物的形成或原始挥发性化合物数量的变化。当气体接触传感器时会发生氧化还原反应，从而可以改变传感器导电材料的导电性。采用适当的采样系统可以提高分析质量。顶空气体采样系统通过消除影响传感器响应的任何不利因素，可提供稳定和可重复的采样，含有挥发性化合物的样品的顶部空间通过气流输送到传感器室。读取响应值后，用惰性气体电流吹扫两个腔室，以去除任何可能的残余气味，并避免交叉污染。具体而言，将5 g样品置于20 mL玻璃瓶中进行电子鼻分析，以提供固、气相处于平衡状态的环境。对每个样品进行2 次重复，取平均值用于进一步分析。

1.4 多元统计分析

在本研究中，使用Matlab2015a和（美国Mathworks公司）和Unscrambler X 10.4软件进行数据预处理和模型开发。首先，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）检测分组模式。然后通过线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）分别对产毒菌株和非产毒菌株、根据菌落总数、AFB含量超标与否进行定性分析。这些方法在文献中被广泛使用，并对其进行了大量描述。通过外部验证结果评估LDA和PLS-DA模型。在外部验证中，采用Kennard-Stone算法，将6组样品的数据分别按2∶1的比例随机分成建模集和预测集。LDA和PLS-DA分类模型的性能通过正确分类样本的百分比和假阳性/阴性错误评估。

2 结果与分析

2.1 花生样品菌落总数与AFB1含量分析

2.1.1 菌落总数分析

由图1a可知，空白组平均菌落总数明显低于实验组，不同菌株的生长速率也不同，黄曲霉142801菌落总数在贮藏2 d后明显高于其他菌株。贮藏初期，霉菌生长缓慢，甚至有些菌落总数减少，可能是由于花生表面接种菌株，其生长需要适应新的环境。除第1天外，空白和污染样品的菌落总数均呈上升趋势，感染程度继续加深，这说明随着时间的推移，霉菌在样品中生长，产生大量的代谢物，从而使花生样品挥发性成分更加复杂。因此，它为基于气味信息的污染样品的快速识别提供了可能。参照前人的研究，花生样品按菌落总数可分为合格（＜2.7（lg（CFU/g））和霉变（≥2.7（lg（CFU/g））两个阶段。空白样品在前6 d虽合格，但从第3天开始，由于环境影响，菌落总数也在稳步上升。除黑曲霉186380外其他接种的样品在第3天均达到发霉状态，而接种黑曲霉186380样品第5天达到发霉状态。

图1 花生样品贮藏0～6 d的平均菌落总数（a）和平均AFB1含量（b）Fig. 1 Average number of colonies (a) and average AFB1 content (b) in peanut samples stored for 0–6 days

2.1.2 AFB含量分析

由图1b可以看出，黑曲霉186380、黄曲霉185691和空白组无明显变化，主要是由于这两种菌株为非产毒菌株，虽然会有霉菌繁殖，却并未产生AFB。而寄生曲霉335939、黄曲霉142801和黄曲霉185860为产毒菌株，霉菌繁殖的同时产生了有毒的真菌次级代谢物，从而呈上升趋势。参照GB 2761—2017，样品可根据AFB含量分为两类：正常（＜20 μg/kg）和污染（≥20 μg/kg）。黑曲霉186380、黄曲霉185691和空白组在第7天前均正常且含量远低于20 μg/kg。然而，其他样品在第3天被污染，且在贮藏后期由于繁殖迅速，产生大量毒素，危害人畜健康。因此，在更严重的情况发生前的早期确定污染水平具有重要意义。

2.2 电子鼻信号分析

从图2a可知，不同污染样品之间具有相似的趋势，但仍存在一些差异。其中LY2/G、T30/1、T70/2和PA/2的响应值有显著差异，而LY2/LG、LY2/gCT和P40/1的响应值无明显变化。参考其他文献中描述各传感器的检测范围，花生霉变后可能产生碳氢化合物、芳香族类化合物等物质，且不同的真菌会产生不同的次生代谢产物，因此与这些产物相关的传感器就会发出不同信号。花生结果表明，6种不同样品的挥发性成分存在差异，为电子鼻技术区分不同霉菌侵染花生提供了可行性。

图2 花生样品贮藏第4天（a）、黄曲霉185860污染样品在不同贮藏阶段（b）12个传感器响应值的雷达图Fig. 2 Radar chart of 12 sensors’ response values for all peanut samples on the fourth day of storage (a) and radar chart of A. flavus 185860 contaminated samples at different storage stages (b)

由图2b可知，黄曲霉185860污染样品与其他被污染样品有类似响应雷达图。随着贮藏时间的延长，不同传感器呈现出一定变化趋势。T30/1、T70/2和PA/2的响应信号随污染程度的增加而逐渐减弱，而LY2/G、LY2/AA和LY2/GH的响应信号逐渐增强。说明在霉菌代谢过程中消耗花生中的营养物质，并产生胺、氨类化合物等物质，导致代表不同物质的电子鼻传感器发出不同的信号，因此为电子鼻技术区分不同霉变程度的花生提供了可行性。

2.3 PCA结果

采用3种不同分类方法对花生样品进行了PCA。PC1和PC2均代表99%以上的方差贡献率，占原始数据方差贡献率的大部分，可以解释大多数样本感染水平的差异。

图3a是根据5种菌株是否产生黄曲霉毒素将样本分为两组（产毒菌株和非产毒菌株），分别为105 份和70 份样品。从图3a可以观察到一定的聚类趋势。虽然有一小部分样本重叠，但大多数样本可以被区分，产毒菌株污染的样品大多数位于非产毒菌株污染样品的右上方。

图3b、c分别以AFB含量20 μg/kg、菌落计数2.7（lg（CFU/g））为阈值，将样品分为正常/超标及合格/霉变两类。然而，样品之间没有明显的分离，原因可能是不同菌株信息的复杂度高或不同菌株之间存在相互干扰。但从图中也可以看出污染样品一部分位于可接受样品的上方。综合观察图3b、c可以看出毒素超标的样品均达到了霉变，而某些样品虽然达到了霉变程度，但其黄曲霉毒素含量并未超标，这类样品可用于动物的饲料。

尽管PCA结果并不理想，但这些差异仍为进一步的判别分析提供了基础。

图3 3种不同分类方法PCA结果Fig. 3 PCA results with three different classification methods

2.4 识别模型的开发和验证

PCA可以得到样本间的聚类趋势，但不能得到具体的分类结果。因此，LDA和PLS-DA模型被用来提高样品之间的分离度。LDA模型是基于PCA得到的前10个PCs，因为它们覆盖了原始数据中包含的大多数变化（＞99%）。PLS-DA是一种基于偏最小二乘回归的有监督分类方法。它可以检测数据与分类变量之间的关系，并可用于未知样本的分类预测。样本将被分成几组，其中2/3样品用于建模集，其余1/3样品用于预测集。

2.4.1 产毒菌株和非产毒菌株污染样品分类结果

表1 产毒菌株和非产毒菌株污染样品分类结果Table 1 Classification results of contaminated samples with toxigenic and non-toxic strains

将5种真菌污染的样品分为产毒菌株和非产毒菌株污染样品。黄曲霉142801、黄曲霉185860和寄生曲霉335939为产毒菌株污染样品（105 份），黑曲霉186380和黄曲霉185691为非产毒毒菌株污染样品（70 份）。样品分类结果见表1。结果显示，LDA和PLS-DA模型能较好地区分同一贮藏时间下产毒菌株和非产毒菌株污染样品，除第0天LDA模型外，建模集和预测集均达到100%，其中第0天仅有1 份样品被误判。所有样品LDA和PLS-DA模型的建模集正确率分别为95.73%和97.44%，预测集正确率均为96.55%，分别有7 份和5 份样品被误判，可能由于不同霉菌的繁殖速率不同，导致不同节点产生的挥发性成分变化复杂，存在相互干扰。

2.4.2 根据AFB含量分类结果

表2为根据AFB含量（正常和超标）对样品进行分类。所有平均建模集正确率为99.28%，平均预测集正确率为87.25%。LDA模型中，黄曲霉185860组中有1 份样品被误判，寄生曲霉335939、黄曲霉142801组中分别有2 份样品被误判，仅有寄生曲霉335939组样品假阴性误判率为5.0%，其余均为正常样品被误判为超标样品。PLS-DA模型结果与之相似。另外，全部样本模型的建模集正确率分别为90.71%和91.43%，预测集正确率均为90.00%。在贮藏过程中，花生样品中的脂肪、蛋白质等营养物质会被霉菌消耗，从而产生大量的毒素和挥发性物质，导致电子鼻的响应值与贮藏前有较大差异。但霉菌产生的挥发性成分复杂，可能会存在互相干扰。沈飞等利用电子鼻技术检测糙米中的黄曲霉毒素，显示电子鼻信号与糙米中AFB、AFB、AFG、AFG及总量之间均有较高相关性，其中对AFB的预测精度最高。因此电子鼻技术对霉菌毒素的快速检测具有可行性。

表2 根据AFB1含量分类结果Table 2 Results of classification according to AFB1 content

2.4.3 根据菌落总数分类结果

表3为根据菌落总数（合格和霉变）对样本建立的LDA和PLS-DA模型结果。对于感染同一菌株的样本，模型的平均建模集正确率为95.65%，预测集正确率为86.44%。在两个模型中，黄曲霉185691组、黄曲霉185860组分别有2、3 份样品被误判，寄生曲霉335939组中有2 份样品被误判，黄曲霉142801组中有1 份样品被误判，而黑曲霉186380组最多，有5 份样品被误判。但除黑曲霉186380组有2 份外，其他仅有1 份发霉样品被误分类为合格样品。假阴性非常重要，因为霉变样本的错误分类会增加真菌感染和真菌毒素暴露的风险。另外，在210个样本中，建模集和预测集的正确分类率分别为85.00%、81.69%和80.28%。可能出现的原因是不同霉菌之间挥发性成分复杂，存在互相干扰。除此之外，位于阈值附近的样品也容易发生误判。刘鹏利用电子鼻技术检测花生受不同霉菌的污染程度，其真菌生长的水平同样随贮藏时间而变化。因此LDA、PLS-DA能够识别和分类有无真菌感染的样本，以及不同贮藏时间的真菌感染程度的样本。

表3 根据菌落总数分类结果Table 3 Results of classification according to number of colonies

基于不同方面分别对电子鼻数据进行建模分析，结果表明，可以根据菌株产毒能力、菌落总数、毒素含量分别进行定性分析，模型正确率在80%以上。在实际生活中，某些受污染的花生虽然霉变，但并未产生AFB，此类花生可用于动物的饲料，可大大减少资源的浪费。将菌株产毒能力结合菌落总数共同建立模型，样品分为4 类：合格/非产毒菌株污染样品、霉变/非产毒菌株污染样品、合格/产毒菌株污染样品、霉变/产毒菌株污染样品。其中建模集总正确率为81.42%，预测集总正确率为74.29%。为区分霉变但含少量毒素的这类样品提供了可能性。此外，有些样品虽然受到产毒菌株的污染，但如果在早期得到检测，较早地采取措施，也可以避免花生的浪费。将菌株产毒能力结合AFB含量共同建立模型，由于非产毒菌株污染样品的毒素含量远低于超标含量，故将样品分为3 类：非产毒菌株污染样品、正常/产毒菌株污染样品、超标/产毒菌株污染样品。其中建模集总正确率为84.29%，预测集总正确率为85.71%。因此可以早期区分出正常/产毒菌株污染样品，这类样品可通过降解毒素等方式用于其他用途。将菌落总数结合AFB含量共同建立模型，样品分为3 类：正常/毒素未超标样品、霉变/毒素未超标样品及霉变/毒素超标样品。建模集总正确率为82.14%，预测集总正确率为81.43%。以上结果表明，电子鼻技术为同时快速检测花生样品中霉菌和黄曲霉毒素污染提供了一种新的可能手段。然而在实际情况下，受霉菌菌属多样性、花生品种和贮藏环境等多方面的影响，模型精度和稳健性可能会有所降低。因此，进一步应通过不断扩充样本数量、采用自然霉变花生等方式，不断验证和改善分析模型性能，以满足实际检测需求。

3 结 论

探讨了电子鼻技术在花生霉菌和黄曲霉毒素污染同步快速检测中的应用。PCA结果显示样品在不同霉菌污染下有一定的聚类趋势；采用LDA、PLS-DA法可以很好将单一霉菌侵染样品的霉变程度及毒素含量进行分类，正确率均在80%以上。同样也采用这些方法对全部样品进行分类，对产毒菌株样品和非产毒菌株样品分类正确率超过95%，根据霉变程度及毒素含量分类正确率也在80%以上，均取得了较高的分析准确率。综上可知，基于电子鼻传感的气味分析技术，在花生霉变状态和毒素污染程度同步快速识别方面具有可行性，为花生等粮油霉变早期监测和风险评估提供了一种新的技术手段。