葡萄种质果实有机酸组分及其含量特性

牛生洋，刘崇怀，刘 强，樊秀彩，张 颖，孙 磊，张晓利,,*，姜建福,*

（1.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003；2.中国农业科学院郑州果树研究所，河南 郑州 450009）

葡萄是世界上最古老、栽培面积最广、经济价值最高的果树之一，其果实既可以鲜食，也用于果脯、制汁或酿酒等，具有很高的经济和食用价值。近年来关于葡萄果实品质的研究多集中于颜色、质地、大小等果实外观品质，然而对葡萄果实香味、营养物质、口感等内在品质研究较少。内在品质是评价果实商品食用价值的重要因素，包括糖酸组分及含量、香味、质地等，尤其是糖酸组分及含量是决定果实风味的重要指标。酸度是葡萄品质感知的主要驱动因素，直接影响消费者的偏好程度。

葡萄中的有机酸包括苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸等。葡萄有机酸是果实代谢的主要产物之一，它的分布特征和浓度大小与葡萄果实加工特性及化学成分有着密切关系，有机酸会直接影响葡萄产品的口感平衡、化学稳定性和pH值大小。酒石酸不但是果实中主要的不可发酵可溶性酸，还是葡萄酒中的主要酸种类，对葡萄酒的风味、口感和陈酿潜力有重要影响。与酒石酸相比，苹果酸则较为柔和，酸味爽口，给人以愉快的感觉，但高含量的苹果酸会造成葡萄酒中乳酸含量过高，影响葡萄酒品质。柠檬酸及草酸虽然在葡萄中含量较低，但对葡萄果实风味都有重要影响。

有关葡萄有机酸组分研究已有报道，但结果不尽一致。Lamikanra等研究发现葡萄浆果中有机酸主要为酒石酸，约占总酸含量的84%，同时，还表明在葡萄浆果存在少量的乙酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸，以及微量的草酸与琥珀酸。Beara等研究发现酿酒葡萄中还含有其他种类的酸，如吡咯烷酮羧酸、戊二酸和2-酮戊二酸等。Topalovic等研究发现葡萄不同发育时期，果实中有机酸含量也会发生变化，通常苹果酸和酒石酸会在葡萄果实中先积累，然后到转色期苹果酸含量会急剧下降，酒石酸含量缓慢增加直至不变。酒石酸与苹果酸比例差异是种质特异性的表现，主要由遗传背景决定。数理统计分析方法在果品风味品质研究中已逐步得到应用，借助数理统计方法能够有效揭示指标之间的变化趋势和定量关系。目前，潘照等利用多元线性回归分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）法和聚类分析法等方法，对鲜食葡萄果实品质评价指标、体系及标准进行了研究，开发并建立了鲜食葡萄品质的关键数据库。江雨则利用PCA法和聚类分析方法着重研究部分中国野生葡萄的果实品质。但前人研究尚未将不同用途、不同种质间葡萄果实有机酸组分及含量的差异进行对比分析，且样本容量也相对较少。因此，本研究以国家果树种质郑州葡萄圃保存的302 份葡萄种质资源为研究对象，进行葡萄有机酸组分及含量的相关研究，对比不同用途、不同种质间葡萄果实有机酸组分及含量的差异，了解其有机酸含量的分布特性，明确国内富含有机酸组分的葡萄果实，以期为葡萄种质资源的充分利用和评价提供一定依据及数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品于2020年在中国农业科学院郑州果树所国家果树种质郑州葡萄圃中采集。参与实验的葡萄种质样品共302 份（表1），每份种质3组重复。

根据往年调查采收期，在葡萄果实采收期内监测果实可溶性固形物的变化，直至其稳定，种子颜色完全变褐，开始进行果实采样。每份种质取100 粒大小均匀、成熟度一致、无病虫害的葡萄果实用于指标测定。将葡萄果实榨汁，经10 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清液于50 mL离心管中，经液氮冷冻后，置于-80 ℃冷藏备用。

表1 实验使用的葡萄种质样品Table 1 Grape germplasm samples used in this study

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪（配有2707自动进样器、2414示差折光检测器、2998二极管阵列检测器） 美国Waters公司；料理机 九阳股份有限公司；砂芯过滤装置 津腾实验设配有限公司；pH-100A酸度计 上海平轩科学技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有机酸组分及其质量浓度的测定

参照黄艳等的方法进行。

1.3.2 可滴定酸的含量和葡萄pH值的测定

可滴定酸含量的测定按照GB/T 12293—1990《水果、蔬菜制品 可滴定酸度的测定》中电位滴定法；pH值采用酸度计测定。

1.3.3 样品酸度值的测定

酸度值计算公式如下：

式中：100、125、130、40分别为柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸的酸度值；、、、分别为样品中柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸的质量浓度/（mg/mL）。

1.4 数据处理

利用Excel 2014进行趋势分析，利用SPSS 20统计软件进行相关性分析，利用Origin 2019软件进行统计分析、PCA，利用R语言进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄果实中有机酸组成与含量特征

图1 不同葡萄中4种有机酸组分及其含量分布图Fig. 1 Contents of four organic acids in different grape samples

从图1可见，302 份葡萄种质的有机酸组分均以酒石酸为主，占有机酸含量的54.87%～69.78%；其次为苹果酸，含量占19.83%～34.68%；柠檬酸含量占4.87%～13.01%；草酸含量最低，仅占0%～6.69%。因此，葡萄属于酒石酸优势型水果。

结果表明，93.8%的葡萄种质酒石酸含量高于苹果酸；5.12%的种质苹果酸含量与柠檬酸相当（两者之差不大于2%），如黑汉葡萄的苹果酸与柠檬酸含量极为接近，分别占16.67%和16.78%；另有7.37%的种质苹果酸含量高于酒石酸。此外，有些葡萄种质的某一项或几项指标极高或极低。例如，酒石酸含量极低（＜30%）的葡萄种质有1 份（碧香无核），而含量极高（≥85%）的葡萄种质有3 份（Reliance、维金娜斯、高墨）；苹果酸含量极低（＜10%）的种质有4 份（着色香、蓓蕾玫瑰、洛阳冯举沟桑叶、维金娜斯），极高（≥58%）的样品仅有1 份（桦叶葡萄老君山）；草酸含量极高（≥5.0%）的葡萄种质有5 份（白玉霓、红伊豆、京可晶、京玉、井州1060）；柠檬酸含量极高（≥40%）的样品有1 份（河岸葡萄）；可滴定酸含量极高（≥85%）的样品有信阳毛葡萄和山葡萄N43-3野生葡萄，其中山葡萄N43-3的总酸质量浓度最高，为21.23 mg/mL，而安吉文的总酸含量最低。

2.2 不同用途的栽培种葡萄有机酸组成及其相关指标平均值比较

不同用途的栽培种葡萄有机酸质量浓度存在差异（表2）。酿酒葡萄酒石酸质量浓度明显高于其他用途的葡萄，而鲜食与酿酒葡萄的酒石酸与苹果酸质量浓度的平均比值无显著差异（＞0.05）。酒石酸的酸性强于苹果酸，可降低果汁的pH值。这可能导致酿酒葡萄的pH值低于鲜食葡萄与制汁葡萄。

表2 不同用途葡萄的有机酸组成及指标比较Table 2 Compositions of organic acid composition in grapes used for different purposes

2.3 不同葡萄种群的有机酸组成及相关指标平均值比较

对比不同种质葡萄中有机酸质量浓度发现，东亚种群葡萄有机酸质量浓度均高于其他种群，尤其是酒石酸质量浓度（表3）。种间杂种与北美种群葡萄的酒石酸质量浓度不存在显著差异；种间杂种与欧亚种葡萄的草酸、苹果酸、柠檬酸质量浓度均无显著差异。东亚种群葡萄的酒石酸与苹果酸质量浓度之比最低，显著低于其他葡萄种群；而种间杂种葡萄的比值最高。种间、欧亚、东亚和北美种群葡萄的pH值之间均存在显著差异。欧亚种的pH值最高，东亚种群葡萄的pH值最低。

表3 不同种群葡萄的有机酸组成及指标比较Table 3 Comparison of organic acid composition of different varieties of grapes

2.4 葡萄中有机酸组分及其相关指标的变异情况、相关性、PCA和聚类分析

2.4.1 葡萄有机酸组分及其相关指标的变异情况

从表4可见，样品间pH值及可滴定酸含量变异系数相对较小，表明样品间pH值、可滴定酸的差异较小；而草酸、苹果酸和柠檬酸质量浓度变异系数相对较高，表明样品间草酸、苹果酸和柠檬酸质量浓度差异大；酒石酸质量浓度、总酸质量浓度和酸度值的变异程度中等。将各指标进行检验，发现8 项指标中除葡萄pH值呈正态分布外（＞0.05），其余各项指标均呈现偏态分布。

表4 不同葡萄有机酸组分变异情况Table 4 Variation coefficients of organic acids among different grape samples

2.4.2 葡萄有机酸质量浓度及其相关指标的相关性分析

表5结果表明，酒石酸与草酸质量浓度无显著相关；除pH值与草酸质量浓度外，酒石酸质量浓度与有机酸其他指标间均呈显著正相关。总酸质量浓度与酒石酸、草酸、苹果酸、柠檬酸质量浓度、可滴定酸含量、酸度值均呈显著正相关。除草酸质量浓度外，pH值与有机酸其余指标均呈显著负相关；其中pH值与可滴定酸含量的相关系数绝对值最大，为0.973。酒石酸与苹果酸质量浓度的比值与苹果酸质量浓度的相关系数绝对值最大（0.521），其次是酒石酸质量浓度（0.396）。同时，酒石酸与苹果酸质量浓度的比值与pH值等呈显著负相关，而与可滴定酸含量等呈显著正相关。

表5 不同葡萄种质有机酸组分及其相关性Table 5 Correlation among organic acids of different grape varieties

2.4.3 葡萄有机酸质量浓度及其相关指标的PCA

利用有机酸组分、pH值、可滴定酸含量、酸度值、总酸质量浓度等作为不同的维度进行PCA，自动拟合出3个PC。由表6可知，前3个PC的累计贡献率已达到88.80%（＞85%），说明在变量不丢失的前提下，这3个PC可以包含原始数据88.80%的信息，因此可以用这3个PC代表9个酸有关指标进行分析和评价。其中酸度值的载荷值在PC1中最大，说明酸度值对PC1影响较大，因此选择酸度值代表PC1。在PC2中酒石酸与苹果酸质量浓度的比值的载荷值最大，说明酒石酸与苹果酸质量浓度的比值对PC2的影响较大，因此选择酒石酸与苹果酸质量浓度的比值代表PC2。PC3综合了柠檬酸、草酸质量浓度两个指标，但是草酸质量浓度的载荷值大于柠檬酸质量浓度的载荷值，因此可用草酸代表PC3。上述分析可得，评价葡萄有机酸品质的3个核心指标可为酸度值、酒石酸与苹果酸质量浓度的比值、草酸质量浓度。

表6 葡萄果实有机酸组分的因子载荷矩阵、方差贡献率及初始特征值Table 6 Factor loading matrix, variance contribution rate and initial eigenvalues of organic acids in grape berries

PC1与PC2的累计方差贡献率达到了77%以上（表6），表明PC1与PC2两个PC可以代表其他指标进行分析。因此，选取PC1、PC2，在PC1-PC2平面上作不同葡萄种质PC散点图。由图2可见，东亚种群葡萄、种间杂种、欧亚种群、北美种群葡萄PC之间有着明显区别；此外，种间杂种与欧亚种群葡萄主要集中于坐标轴左上方附近，且两者的重叠度较高，这可能是因为欧亚种与欧美杂种在亲缘关系上比较近。

图2 葡萄果实有机酸组分PCA散点图Fig. 2 Scatter plot of PC1 versus PC2 for analysis of organic acids in grape berries

2.4.4 葡萄有机酸质量浓度及其相关指标的聚类分析

图3 葡萄种质有机酸组分的聚类分析图Fig. 3 Cluster analysis of organic acids of grape varieties

聚类分析结果表明，302 份葡萄种质一共可以分成四大类（图3）。其中第1类（红色）主要由华东葡萄、腺枝葡萄等12 份野生葡萄种质聚类在一起。第3类（绿色）由65.87%欧亚种、32.23%欧美杂种、1%的欧山杂种和1%的美洲种组成；其中欧山杂种和美洲种葡萄分别为熊岳白葡萄和公酿1号、早康可和俄罗斯康可。而第2类（蓝色）则是由16 份欧美杂种、27 份欧亚种、5 份野生种、4 份欧山杂种和3 份美洲种葡萄组成；其中白比诺、佳丽酿、霞多丽等酿酒葡萄在第2类中占到了56.36%，而鲜食与制汁种质在其中仅占了43.64%；此外，第2类中的5 份野生种质为高山2号、福安刺葡萄、高山1号、圆叶葡萄、蘡薁-林县；其中，福安刺葡萄、高山1号、高山2号等野生葡萄多作为酿酒葡萄使用。第4类（紫色）由11 份种间杂种、5 份欧亚种和9 份野生种葡萄组成；其中9 份野生种葡萄包括4 份刺葡萄、3 份桑叶葡萄、1 份华东葡萄、1 份秋葡萄。

3 讨 论

果实有机酸含量高低直接影响葡萄果实品质，不同葡萄种质的有机酸含量与组分差异较大，筛选低酸高糖的葡萄种质，培育风味特异的葡萄新种质对葡萄产业具有重要意义。葡萄有机酸约占果汁总质量的1%，其中酒石酸与苹果酸为有机酸的主要成分（约占总酸的90%），其他有机酸如柠檬酸、草酸和其他酸的含量受环境条件和品种的影响。

实验中302 份葡萄种质的有机酸以酒石酸为主（1.54～12.67 mg/mL），其中山葡萄N43-3有机酸质量浓度最高，安吉文质量浓度最低；其次是苹果酸（0.33～9.88 mg/mL），桦叶葡萄老君山的苹果酸质量浓度最高，而Reliance的苹果酸质量浓度最低；柠檬酸和草酸均少量存在于葡萄果实中。其中柠檬酸与草酸质量浓度与前人的检测结果稍有出入，可能与葡萄品种或品系的差异（内因）及葡萄生长环境（光照、水分、温度）不同有关。

栽培种葡萄果实中有机酸质量浓度由高到低为酒石酸、苹果酸、柠檬酸、草酸，符合葡萄果实中不同有机酸分布规律，保证本研究数据可靠性。而野生种葡萄中，除刺葡萄株系外，桑叶葡萄、腺枝葡萄、华东葡萄、河岸葡萄等果实中苹果酸质量浓度均高于酒石酸，是酒石酸质量浓度的1.2～1.7 倍，其原因有待进一步探讨。但从整体而言，栽培种葡萄有机酸质量浓度普遍低于野生种葡萄，这是因为栽培品种葡萄经过人为选育，有机酸质量浓度逐渐降低，而野生种葡萄未经过人为选育，保留着原始的特性。

目前，葡萄种质资源的选育一直是以降酸为目的。但是李纪明等研究表明高糖高酸的葡萄种质更适合酿酒；刘怀峰研究也表明高酒石酸含量会在一定程度上提高浆果的酿酒品质，酒石酸含量较高的品种会使葡萄酒的颜色、氧化性更加稳定，而低酒石酸的葡萄种质酿造的葡萄酒酒体平淡、瘦弱，从而产生“泛浑病”。因此，酿酒时适量增加有机酸含量，可以使酒体更加丰满、醇厚。本研究302 份葡萄种质中野生种葡萄有机酸质量浓度是栽培种葡萄的2～10 倍，由此可见野生葡萄资源中具有十分丰富的有机酸资源，是提供可食用有机酸的途径之一。我国是东亚种群葡萄主要分布地，其中刺葡萄、山葡萄、毛葡萄等中国野生葡萄株系，已经应用在我国酿酒工业上，为我国的酿酒资源的增加做出贡献。同时，高酸低糖特性使山葡萄、毛葡萄等中国野生葡萄亦可以作为种质育种时父母本，为我国的育种与资源保护做出贡献。

研究者对多样品多指标的品质分析越来越广泛地应用PCA和聚类分析。聚类分析结果表明，302 份葡萄种质可以分成四类：第1类主要是由野生葡萄组成，均为高有机酸的葡萄种质；第2类不仅包括酿酒葡萄，还含有少量刺葡萄种质（如高山1号、高山2号等），可能是因为这部分刺葡萄种质的有机酸组分与酿酒葡萄较为接近，因此这部分刺葡萄种质亦可作为酿酒葡萄资源。本研究通过对酒石酸、柠檬酸、草酸和苹果酸共4个组分的聚类分析发现，华东葡萄、腺枝葡萄、山葡萄等12 份种质为酒石酸、苹果酸和总有机酸质量浓度较高的特异资源，可作为获取这些组分的重要种质并加以利用。有机酸是葡萄果实代谢的主要产物之一，具有丰富的开发利用潜能。山葡萄、毛葡萄是有机酸质量浓度较高的特异种质，可在奋力提取或开发其功能产品时作为重要原料。中国野生葡萄资源十分丰富，国内研究者尚未对葡萄有机酸进行全面、系统的评价，因而对葡萄有机酸进行系统全面的评价亟待进行，以便对于中国野生葡萄资源的进一步开发利用。

4 结 论

302 份葡萄种质的有机酸主要为酒石酸、苹果酸和柠檬酸，其中山葡萄N43-3总酸质量浓度最高（21.23 mg/mL），安吉文的总酸质量浓度最低（2.91 mg/mL）。在不同葡萄种群中，东亚种群葡萄的总酸质量浓度最高，其次是北美种群，欧亚种群的总酸质量浓度最低，而在不同用途葡萄种质中，酿酒葡萄的总酸质量浓度远高于其他两个用途的葡萄。