不同冲泡次数普洱生茶浸出物含量及滋味品质变化分析

李 燕，王文富，王金涛，胡永丹，任达兵，易伦朝

（昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650500）

云南省是普洱茶主要产地，国家质量监督检验检疫总局在2008年将普洱茶设为地理标志性产品（GB/T 22111—2008），并按加工工艺及品质特性的不同将其分为普洱生茶与普洱熟茶。根据中国茶叶流通协会数据显示，普洱茶产量产值近年来呈稳定增长趋势，2019年中国普洱茶产量约为15.5万 t，较前一年度上涨1.5万 t；普洱生茶也因其独特的风味特点以及较高的收藏价值在中国和其他亚洲国家越来越受欢迎，市场需求也随之在逐步扩大。

普洱生茶属于非发酵茶，是以云南大叶种晒青毛茶为原料，经精制、蒸压、干燥工艺制成，将其归属于绿茶的一种，含有丰富的内含物质；其茶性较为刺激，新茶品质接近于绿茶，滋味品质特点是浓厚回甘。目前已有大量研究表明普洱生茶具有降血脂、预防心血管疾病、抗癌抗突变、抗氧化、增强机体免疫力等多种保健功能。普洱生茶具有一定的耐泡性，在T/YGPH 02—2018《收藏级古树普洱茶（生茶）》中提到其耐泡性的感官特征为经久耐泡，顺手泡15 次不掉水。

传统的感官审评方法是判断茶汤滋味品质最基本的方法，可用此方法评价茶汤的滋味品质，但现阶段对于不同冲泡次数下茶汤中浸出物变化与滋味品质的关系并不清楚。目前研究者利用高效液相色谱法、分光光度法、氨基酸分析仪等技术对冲泡过程中茶汤的浸出物如茶多酚、咖啡因、游离氨基酸、总黄酮、水浸出物等进行分析。上述方法难以全面、准确地反映茶汤在冲泡过程中浸出物的变化。超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术具有高通量、高选择性、高灵敏度等优点，为全面、准确地表征茶汤中浸出物的变化提供一种有效的手段。本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱技术，对茶汤中的浸出物进行较为全面细致的分析，采用GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》对茶汤的滋味品质进行审评，结合普洱生茶的耐泡性特征，探讨10 次不同冲泡次数下茶汤浸出物含量变化及其与滋味品质之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普洱生茶，原料为云南大叶种晒青毛茶，采自云南省西双版纳傣族自治州勐海县章朗老寨。

甲醇、乙腈（均为质谱级） 德国Merck公司；甲酸（质谱级） 美国Honeywell公司；76种标准品，纯度均在97%以上；云南山泉 云南大山饮品有限公司。

1.2 仪器与设备

UltiMate 3000超高效液相色谱仪、Q Exactive台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪 美国Thermo Scientific公司；SK5200GT超声波清洗器 上海科导超声仪有限公司；Milli-Q A10超纯水机 德国Merck公司；MS105DU电子分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

参照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》冲泡茶叶。准确称取5.0 g普洱生茶于250 mL审评杯中，加入250 mL沸水，因普洱生茶是绿茶的一种，故按绿茶的冲泡时间标准，加盖冲泡4 min，每一泡5个平行，冲泡后按冲泡次序依次滤出茶汤于评茶碗中，共冲泡10 次。每次冲泡后的茶汤取样至2 mL容量瓶中，加入10 μL内标溶液（200 μg/mL葛根素与磺胺醋酰），定容。用注射器吸取混匀后的供试液1 mL过0.22 μm微孔滤膜于进样瓶中，4 ℃保存备用。

1.3.2 茶叶感官审评

参照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》对茶汤滋味进行审评。滋味总体评分满分为100分，评分标准参考GB/T 22111—2008《地理标志性产品 普洱茶》、T/YGPH 01—2018《古树普洱茶感官审评评分》2个标准中普洱生茶的滋味品质特征设计（表1）。滋味分属性，包括苦度、涩度、甜度、鲜度、厚度的评价10 分制（0～2 分非常弱，2～4 分弱，4～6 分中等，6～8 分强，8～10 分非常强）。感官评价小组由5 名经过茶叶感官审评培训的成员组成。

表1 茶汤滋味总体评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of the taste of tea infusion

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温35 ℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸溶液；流速0.2 mL/min；进样量1 μL。

洗脱梯度：0～3 min，5%～7% A，95%～93% B；3～4 min，7%～10% A，93%～90% B；4～8 min，10% A，90% B；8～15 min，10%～40% A，90%～60% B；15～18 min，40%～50% A，60%～50% B；18～20 min，50%～5% A，50%～95% B；20～25 min，5% A，95% B。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源，正负离子扫描模式；喷雾电压分别为3 500 V（+）、4 000 V（-）；雾化温度300 ℃；雾化气（鞘气）流速30 L/min；辅助气流速10 L/min；传输毛细管温度320 ℃；扫描模式：全扫描（Full scan），分辨率35 000；源内诱导裂解电压0 eV；数据依赖二级扫描，分辨率17 500；高能碰撞诱导电压分别为25、35、45 eV。

1.3.5 茶汤中浸出物的定性定量

定性分析：使用Xcalibur 3.0软件，通过现有标准品的保留时间、一级与二级的质谱信息，且参照Tea Metabolome Database（TMDB）、Human Metabolome Database（HMDB）等代谢组学数据库及参考文献[5]中的质谱信息，采用分级定性策略对茶汤中浸出物进行定性。将定性结果分为两级，分别为标准品定性、文献及数据库定性。本研究中通过标准品完成定性的有76种，基于保留时间及质谱信息匹配文献与数据库的有62种。

定量分析：本研究采用内标法定量，正离子模式与负离子模式选用的内标物分别为磺胺醋酰与葛根素。将超高效液相色谱-高分辨质谱采集到的数据导入到MZmine 2.38软件进行去噪声、峰建立、峰平滑、峰解卷积、峰对齐、峰填充、标准化、归一化等处理，基于定性结果，提取出茶汤中浸出物的准分子离子质量、保留时间、峰面积，通过式（1）、（2）分别计算浸出物的相对校正因子及含量：

式中：为相对校正因子；A为标准品混合溶液中内标物的峰面积；A为标准品混合溶液中对照品的峰面积；C为标准品混合溶液中内标物的质量浓度/（mg/mL）；C为标准品混合溶液中对照品的质量浓度/（mg/mL）。

式中：m为浸出物在供试液中的质量浓度/（μg/mL）；A为浸出物在供试液中的峰面积；A为内标物在供试液中的峰面积；m为实际测量时内标物的质量/μg；为供试液的体积/mL。

除76种有标准品的浸出物，其余62种浸出物含量通过式（3）计算，字母定义与式（2）一致：

1.4 数据处理

每组实验做5 次平行，采用Excel 2010进行数据处理、Origin 2019进行绘图、IMB SPSS Statistics 21.0进行Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 冲泡次数对普洱生茶茶汤滋味品质的影响

按绿茶冲泡标准对以云南大叶种晒青毛茶为原料制成的普洱生茶进行审评。如图1A所示，在前6 次冲泡得分均达到80 分以上，呈现尚耐泡的特点。其中1～3 泡滋味总体评分较高，滋味品质良好，在第2泡时达到最高分91 分，其滋味特点为浓醇、回甘持久，在3 泡之后随冲泡次数的增加，滋味总体评分逐渐降低，滋味醇正感不足；6 泡之后得分均在70～80 分之间，茶汤滋味逐渐淡薄，水味渐显；尤其在第9～10泡时，茶汤由于冲泡次数过多、浸出物含量较低使得滋味淡薄如水，无层次感，得分也相应达到最低分。

由图1B所示，茶汤在第1泡时各滋味属性得分较为类似，均在4.55 分上下，综合滋味口感协调，茶叶中的浸出物浸出尚不完全；在第2～3泡时以苦涩味为主，而苦涩味感较强抑制了茶汤中的鲜甜味；第4～5泡中苦涩度下降趋势最为明显，但得分依旧高于鲜甜度，且鲜度在第4泡得分达到与第1泡一致的最高分；在6～10 泡的过程中，鲜甜度得分略高于苦涩度，各滋味属性得分呈下降趋势。茶汤的厚度是其内含浸出物质丰富程度的综合体现，是茶汤中浸出物质在口腔中的综合反应，在10 次冲泡过程中随浸出物的含量而变化。总的来说，苦度、涩度、厚度3个滋味分属性得分在10 次冲泡次数中的变化趋势趋于一致，都在第2泡时达到最高分，后随冲泡次数的增加，得分逐渐降低；而鲜度、甜度得分在1～4 泡过程中，随苦涩度的下降而有所升高，可见普洱生茶茶汤的鲜甜味感更易在苦涩味较低时得以感知。茶汤的苦味、涩味相伴而生，同时二者在很大程度对茶汤的滋味品质产生影响，相关性分析（表2）表明苦度、涩度、厚度与滋味总分成极显著正相关，推测苦涩度以及厚度是影响普洱生茶茶汤滋味品质的关键属性因子；鲜甜味虽与滋味总体评分也呈正相关，但未达到显著水平，研究表明二者在茶汤整体的口感中起到协调作用，可在一定程度上中和茶汤苦涩感带来的刺激性，对滋味品质产生积极的影响。

图1 不同冲泡次数普洱生茶茶汤感官评分Fig. 1 Sensory evaluation scores of Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

表2 滋味总体评分与滋味分属性评分相关性Table 2 Correlation between overall taste and taste attributes

2.2 不同冲泡次数下普洱生茶茶汤中浸出物的变化分析

图2 不同冲泡次数普洱生茶茶汤浸出物变化Fig. 2 Variation in the amount of extractable components in Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

表3 浸出物总量与感官审评结果相关性Table 3 Correlation between total amount of extractable components and sensory evaluation results

茶叶中的浸出物是茶汤中主要的呈味物质，其含量的高低决定着茶汤的滋味品质。由图2A可知，在对普洱生茶进行10 次冲泡的过程中，茶汤中浸出物总量在第2泡时达到最大，从第1泡的561 983.29 μg/250 mL上升至624 111.10 μg/250 mL，且第2泡的浸出物总量约为第3泡的2 倍左右。在2～6 泡过程中茶汤浸出物总量下降趋势最为明显，第4泡茶汤浸出物总量约为第3泡的1/3，这也是感官审评结果中前3 泡茶汤滋味品质更优的原因；第7泡茶汤中浸出物总量较第6泡下降了71.20%，从第7泡开始茶汤滋味品质显著降低。7～10 次冲泡过程中浸出物含量极低，但仍表现出随冲泡次数的增加，浸出物总量逐渐降低的变化趋势。通过茶汤浸出物总量与感官审评结果的相关性分析（表3），表明浸出物总量与茶汤滋味品质密不可分，与茶汤滋味总体评分、涩度呈极显著正相关，与苦度、厚度呈显著正相关。

浸出物的变化与茶汤滋味品质紧密相连，茶汤中不同种类浸出物中呈味物质的相互作用、阈值、含量、比例的不同，造就了茶汤不同的滋味特点。本研究在1～10 泡的普洱生茶茶汤中共鉴定出138种浸出物，包括17种氨基酸、38种儿茶素及其衍生物、38种酚酸及其衍生物、35种黄酮、3种生物碱以及7种其他类成分。

2.2.1 氨基酸类

氨基酸类物质本身因识别阈值不同有不同的呈味特点，根据相关研究表明氨基酸是茶汤中主要的鲜爽味物质。由图2B可知，氨基酸类物质在10 次冲泡过程中相对含量占比并不高，呈现1～6 泡过程中无较大波动，7～10 泡过程中小范围上升的变化趋势。本研究定性出的氨基酸类物质共有17种，结合文献中已报道的滋味属性可分为鲜味氨基酸、苦味氨基酸、甜味氨基酸3种。一般认为，茶汤中的茶氨酸、-天冬氨酸、-谷氨酸为鲜味氨基酸，通过定量结果可知（表4），3种鲜味氨基酸第1～10泡中的相对含量范围分别为2.72%～5.84%、0.10%～0.21%、0.13%～0.35%。茶氨酸在氨基酸类物质中占比最大，相关研究认为其可以提高茶汤的滋味品质，但其滋味阈值较高，鲜甜味阈值为24 000 μmol/L，涩味阈值为6 000 μmol/L，在本研究中茶氨酸既未达到其涩味阈值，又未达到其鲜味阈值，这与文献中报道的结果一致；Kaneko等研究认为，茶氨酸可增加茶汤的鲜味，还可促进谷氨酸钠鲜味的形成，推测茶氨酸在冲泡过程中对茶汤鲜味具有一定的贡献作用，同时协调着茶汤的苦涩味。苦味氨基酸的滋味阈值在20～100 mg/100 mL之间，其中阈值最小的是组氨酸，为20 mg/100 mL，本研究中-组氨酸在第2泡中含量最高，换算后为0.047 mg/100 mL，观察发现在1～10 泡中均未达到其阈值，说明苦味氨基酸在国标法冲泡的普洱生茶茶汤中不是茶汤苦味的主要作用因子；甜味氨基酸的滋味阈值在50～300 mg/100 mL之间，在10 次冲泡过程中6种甜味氨基酸均未达到其阈值。

表4 不同冲泡次数普洱生茶茶汤氨基酸类浸出物含量变化Table 4 Variations in contents of amino acids in Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

表5 不同冲泡次数普洱生茶茶汤儿茶素及其衍生物类浸出物含量变化Table 5 Variations in contents of catechins and their derivatives in Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

2.2.2 儿茶素及其衍生物类

图2B表明在1～10 次的冲泡过程中儿茶素及其衍生物是普洱生茶茶汤中占比最高的浸出物，尤其在前6 泡中占比较高，且整体变化趋势最为明显；其主要呈味特点为苦味与涩味，其占比高、浸出含量大的特点对茶汤的感官品质有决定性作用。儿茶素及其衍生物是茶汤滋味的主要贡献者，结合感官审评结果表明，其总含量变化与茶汤厚度、苦度、涩度密切相关，儿茶素类物质的总含量越高，茶汤的苦涩度越大。表没食子儿茶素没食子酸酯在10 次冲泡过程中的变化趋势最为明显，在第2泡中茶汤苦涩度评分达到最高的同时，其相对含量也是最高，达到20.83%；表没食子儿茶素没食子酸酯的味觉识别阈值是8种主要儿茶素中最低的一种，为190 μmol/L，经计算发现在第2泡时达到1 134 μmol/L，远大于其味觉识别阈值，推测其是影响茶汤苦涩度的关键浸出物。在10 次冲泡过程中，表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯在1～3 泡中均达到其阈值，3 次冲泡之后茶汤中主要的儿茶素含量均降低至阈值之下，结合感官审评结果中茶汤苦涩度的变化趋势可发现，苦涩度评分也在第3次冲泡后有较大的下降趋势。茶黄素类浸出物的味觉识别阈值较小，在13～26 μmol/L之间，结合表5可知4种茶黄素在冲泡过程中浸出含量相对较低，且均未达到其阈值，推测对茶汤的滋味无显著贡献。

2.2.3 酚酸及其衍生物类

酚酸类物质在茶汤浸出物中的整体占比达到第2位（图2B），对比酚酸类物质与其他类物质的变化趋势，发现不同之处在于酚酸类在第1泡时含量达到最大，在第2泡有小幅度下降，后与基本的变化规律保持一致，其在茶汤中对滋味的主要贡献为涩味。没食子素是此类物质中占比最大的物质，其相对含量在第1泡达到11.84%，仅次于表没食子儿茶素没食子酸酯，且在前7泡中相对含量变化幅度较小，保持在6.51%～11.84%之间，没食子素在较低阈值浓度（90 μmol/L）下可呈现出涩味，经计算发现其在1～4 泡中均达到其涩味阈值，特别是1～2 泡中较为明显，前2 泡中达到的平均涩味阈值为746 μmol/L，约为其涩味阈值的8.29 倍（表6）。咖啡酸、绿原酸、没食子酸是茶汤中典型的酚酸类物质，3种浸出物含量的升高可以增强茶汤的苦涩味。

表6 不同冲泡次数普洱生茶茶汤酚酸及其衍生物类浸出物含量变化Table 6 Variations in contents of phenolic acids and their derivatives in Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

2.2.4 黄酮类

黄酮类物质对茶汤贡献的味感为苦味与涩味，但通过Sucharbert等研究发现，黄酮醇苷类物质的涩味阈值远小于儿茶素类物质。研究分析了36种黄酮类浸出物，发现此类物质虽在冲泡过程中浸出的含量较少，但对茶汤滋味起着尤为重要的作用。芦丁本身无明显的滋味特点，但可以与咖啡因发生滋味相互作用，增强咖啡因的苦味，对比本研究中1～10 泡中咖啡因与芦丁相对含量可明显发现二者变化趋势趋于一致（表7）。茶叶中常见的黄酮醇有杨梅素、槲皮素、山柰酚3种，不同的苷元与糖基形成了不同的黄酮醇苷，黄酮醇苷类物质在茶汤中通常呈现较为柔和的涩感。结合Scharbert等对部分呈柔和涩感的黄酮醇苷类物质的阈值结果，发现黄酮醇苷类物质的涩味阈值极小，如异槲皮素、紫云英苷、金丝桃苷的滋味阈值分别为0.65、0.67 μmol/L和0.43 μmol/L，计算发现这3种浸出物在1～7 泡中均达到其阈值，其中异槲皮素只有第10泡时未达到其阈值，推测黄酮醇苷类物质是10 次冲泡过程中影响茶汤涩味的关键物质。其次，由图2B得知黄酮类物质在儿茶素及其衍生物占比下降时呈上升趋势，推测其是后5 泡茶汤中影响茶汤苦涩度的重要影响因子。

表7 不同冲泡次数普洱生茶茶汤黄酮类浸出物含量变化Table 7 Variations in contents of flavonoids in Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

表8 不同冲泡次数普洱生茶茶汤生物碱类及其他浸出物含量变化Table 8 Variations in contents of alkaloids and other compounds in Pu-erh raw tea infusion obtained at different brewing times

2.2.5 生物碱类及其他

茶汤中生物碱类物质主要有咖啡因、可可碱、茶碱3种，生物碱是茶汤中苦味的重要来源。咖啡因是其中含量最高的物质，10 次冲泡过程中相对含量在4.02%～8.62%之间，其味觉阈值为500 μmol/L，是单纯的苦味物质，在第2泡中超过其阈值。由定量结果可知（表8），可可碱在冲泡过程中的变化趋势与咖啡因保持一致，可可碱是咖啡因合成过程中的中间产物，与咖啡因一起对茶汤的苦味带来贡献。

3 结 论

冲泡次数影响茶叶中内含物的浸出、茶汤浸出物的总量及其滋味品质特点。本研究以普洱生茶为研究对象，通过茶叶标准审评法对普洱生茶进行10 次冲泡，并对其冲泡过程中茶汤的滋味品质进行感官审评，应用超高效液相色谱-高分辨质谱分析检测技术，对不同冲泡次数下普洱生茶茶汤中浸出物含量差异进行比较分析。普洱生茶的耐泡性良好，在4 min的冲泡时间下表现出尚耐泡的品质特征，茶汤的滋味品质特点以苦涩味为主；感官审评结果表明，前3 泡茶汤的滋味较佳，第2泡的茶汤滋味品质得分最高。在普洱生茶茶汤中共检出138种物质，儿茶素及其衍生物、酚酸及其衍生物、黄酮类、生物碱类对茶汤滋味贡献集中于苦涩味，而氨基酸类物质协调着茶汤的苦涩味，并在一定程度上提供着茶汤的鲜味。普洱生茶茶汤中浸出物总量与茶汤的滋味总体评分呈显著正相关；茶汤的苦度、涩度、甜度、鲜度、厚度与浸出物含量变化关系密切，均呈正相关。茶汤中各滋味物质的比例、含量不同以及物质间的相互作用，造就了茶汤在10 次冲泡过程中不同的滋味特点。目前消费市场对于普洱生茶的冲泡方式与本研究在冲泡时间上有所不同，消费者日常冲饮普洱生茶的冲泡时间大多在1 min以内出汤，甚至为入水即出的出汤方式。本研究依据绿茶的标准审评冲泡方法，冲泡时间为4 min，较消费者日常的冲饮方式冲泡时间长，达到最佳滋味品质的冲泡次数提前，在第2泡时滋味品质达到最佳。本研究结果可为揭示云南普洱生茶的耐泡性以及不同冲泡次数下茶汤的滋味特点及浸出物含量变化提供有力的数据支撑。