年龄对小鼠植入前胚胎Dnmts表达量的影响

岳明星，简伟杰，李 浡，陈 思，危 晴，陈 亮，辛秀兰

（北京电子科技职业学院，北京 100176）

在胚胎发育中DNA甲基转移酶（Dnmts）起到了关键作用。DNA甲基转移酶3家族中的Dnmt3a、Dnmt3b在成体组织中表达量很低，在胚胎干细胞中表达丰度较高，胚胎干细胞中Dnmt3a和Dnmt3b失活会干扰DNA从头甲基化，小鼠Dnmt3b、Dnmt3a基因突变会导致胚胎畸形及死亡率升高。Dnmt3a和Dnmt3b的功能在胚胎发育早期相似，Dnmt1的甲基化作用发生在植入期，在胚胎发育过程中起维持甲基化的作用。无论是DNA从头甲基化还是DNA甲基化的维持都是胚胎发育的重要环节，这可能与不同组织细胞中不同基因的表达有关。另外，DNA甲基转移酶与早期胚胎植入子宫内膜也有一定联系，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B可以联合作用，调节E钙黏素（E-cadherin）的表达，从而调节子宫内膜对胚胎的接受能力，这也说明了DNMTs在胚胎发育中的重要作用，异常的胚胎植入和流产很有可能与DNMTs的异常有关。

DNA甲基化是指DNA序列上特定的碱基获得一个甲基基团的化学修饰过程。它作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA。这种传递主要通过Dnmt1维持，是一种重要的表观遗传机制。在衰老的细胞中会出现“DNA甲基化漂移”，即衰老的组织和细胞中广泛存在着DNA甲基化程度降低或过甲基化现象。产生这两种现象的主要原因与DNA甲基转移酶的表达异常有关。在人的T淋巴细胞中Dnmt3a表达量处于较低水平，且不随年龄变化而发生改变；而Dnmt1和Dnmt3b表达量很高，并呈现出随年龄增大而降低的趋势。这证明DNA甲基转移酶表达量下降是导致T淋巴细胞甲基化程度下降的原因之一。研究人外周血白细胞5-甲基胞嘧啶含量时发现，人50岁以上组的5-甲基胞嘧啶含量较50岁以下组低，即随着年龄的增长甲基胞嘧啶含量呈下降趋势；但其下降程度很小，下降速度为每年0.014%。以上研究证明，基因组DNA甲基化水平降低的趋势在衰老中是普遍存在的。但在衰老进程中同时伴随着某些基因启动子局部区域5-甲基胞嘧啶含量的增加，如雄性大鼠的精子和肝细胞中核糖体DNA随着年龄的增大发生超甲基化，人类小肠隐窝的干细胞随年龄增长发生高甲基化现象。

越来越多的研究证明，DNA甲基化在机体和细胞衰老过程中发挥重要作用。哺乳动物的生殖细胞和植入前胚胎基因组甲基化经历一个重编程过程，受精后从亲代获得的配子甲基化模式通过去甲基化作用被擦除，在随后植入过程中，新的甲基化模式通过从头甲基化作用被建立。胚胎的甲基化重编程过程对胚胎的发育和细胞全能性的建立具有重要作用。目前，生殖老化对甲基化重编程过程的影响机制仍不清楚。

为了研究老化对小鼠植入前不同时期胚胎Dnmts表达量的影响，本试验利用Western-blot方法，分别检测了青、老年小鼠2细胞和4细胞胚胎、8细胞和桑椹胚、囊胚的Dnmts表达量，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

同一批次昆明白小鼠雌性300只、雄性100只，购自中国军事医学科学院，随机分为两组，一组（100只）为青年组，在青年时期6～8周龄进行相关试验；另一组（200只）饲养到老年时期（35～40周龄），为老年组，在35～40周龄重复青年组所做试验。

小鼠饲养于控温（20～25℃）、控光［14 h光照（06：00—20：00）和10 h黑暗（20：00—06：00）］环境中。所有动物操作均按照北京市实验动物管理条例相关规定执行，符合动物福利的要求。

1.2 主要仪器及试剂

摇床（型号为TS-92）、旋涡混合器（型号为QL-901），购自其林贝尔仪器制造有限公司；台式冷冻离心机（型号为TGL-16），购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；电泳仪（型号为DYCZ-24DH），购自北京六一生物科技有限公司；转膜仪（型号为TY-201-01），购自南京中科通仪科技有限公司；电子天平、冰箱、液氮罐、pH计、注射器、大镊子、吸水纸、记号笔、枪头、离心管、剪刀、滤纸、膜、乳胶手套等均为国产，市购；Eppendorf移液器、显微镜，市购。以上仪器和用品均由北京电子科技职业学院生物工程学院细胞及分子生物学实验室提供。

Dnmt1（A-1001）、Dnmt3a（A-1003）、Dnmt3b（A-1004）、Dnmt3L（A-1005）抗体，购自Epigentek公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（20201ES76），购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Loading buffer、配制M2液所需药品及其他试剂，均购自Sigma公司。

1.3 试验设计

1.3.1 各时期胚胎的采集 青年组（6～8周龄）挑选自然发情的小鼠与8～10周龄正常雄性昆明白小鼠合笼。次日清晨观察小鼠交配情况，有栓小鼠视为交配成功。交配后见栓雌鼠冲取体内胚胎，分别于交配后44～48 h、52～56 h、60～64 h、68～72 h、84～96 h收集2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚。将胚胎用M2液清洗3～5次，同时期每胚胎置于一个EP管中，-80℃保存，备用；老年组（35～40周龄）挑选自然发情小鼠，做上述交配及胚胎采集试验。将5个时期胚胎分为三类：2细胞／4细胞胚胎、8细胞／桑椹胚、囊胚。

1.3.2 样品的制备 取青年、老年小鼠每组胚胎各200个，放入1.5 mL离心管中并加入100μL蛋白裂解液，用玻璃研磨器于冰上匀浆；将匀浆液转移到预冷的1.5 mL EP管中，置于冰上15 min，以充分裂解；4℃、12 000 r／min离心10 min；将离心后的上清液分装转移至1.5 mL离心管中。制备电泳样品，使每个样品总蛋白为50～100μg。根据蛋白浓度计算各样品所需取样量，并与Loading buffer混匀，沸水煮5 min，放入冰盒中快速制冷，备用。上样前按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明书测定蛋白浓度。

1.3.3 Western-blot 配制12%分离胶，加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即摇匀即可灌胶，并用ddHO封胶；凝固后将胶上层水倒去，并用吸水纸将水吸干；配制4%浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。剩余空间灌满浓缩胶，将梳子插入浓缩胶中；取1.3.2样品上样，电泳。浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶电泳电压为120 V。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。

恒流转膜约70 min后，将膜取出放入洗涤缓冲液TBST中洗1次，时间5 min；用封闭液（TBST缓冲液中含5%脱脂奶粉）将膜浸入，室温放置1 h；用封闭液将一抗Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L按1∶200稀释，将膜与稀释后一抗在4℃孵育12 h，孵育结束后用TBST洗3次，每次5 min；用封闭液将辣根过氧化物酶标记的二抗（羊抗兔和羊抗鼠）按1∶1 000稀释后与孵育一抗后的膜37℃共孵育2 h，孵育结束后用TBST洗3次，每次5 min；ECL曝光，显影、定影后用Image J软件分析Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L蛋白相对灰度值。相对灰度值越大蛋白表达量越大，反之亦然，即相对灰度与蛋白表达量成正比。

1.4 数据的统计分析

数据均采用SPSS 12.0软件的独立样本检验进行分析。＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 2细胞／4细胞胚胎中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化过程中表达量的变化

通过Western-blot方法测定青年、老年小鼠2细胞和4细胞胚胎中4种主要DNA甲基转移酶表达量，结果表明，Dnmt1、Dnmt3b和Dnmt3L表达量均随年龄增加而显著下降（＜0.05），Dnmt3a表达量未随年龄增加发生显著变化（＞0.05），见图1。

图1 青年、老年鼠2细胞／4细胞胚胎Dnmts表达量Fig.1 Expression level of Dnmts in 2-4cell embryos of young or old mice

2.2 8细胞／桑椹胚中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化过程中表达量的显变化

通过Western-blot方法测定青、老年小鼠8细胞／桑椹胚中4种主要DNA甲基转移酶表达量，结果表明，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L表达量均未随年龄增加发生显著变化（＜0.05），见图2。

图2 青、老年鼠8细胞／桑椹胚胚胎Dnmts表达量Fig.2 Expression level of Dnmts in 8cell／morula embryos of young or old mice

2.3 囊胚中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L在老化过程中表达量变化

通过Western-blot方法测定青、老年小鼠囊胚中4种主要DNA甲基转移酶表达量，结果表明，Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L表达量均未随年龄增加发生显著变化（＜0.05），见图3。

图3 青、老年鼠囊胚Dnmts表达量Fig.3 Expression level of Dnmts in blastocyst of young or old mice

3 讨论

DNA甲基化与染色质结构、X-染色体失活、印记基因转录静默及组织特异性基因表达等生物过程有关。小鼠胚胎DNA甲基化模式是通过Dnmt1蛋白的正确表达和阶段特异性的翻译来维持的。小鼠Dnmt1基因缺失，突变导致胚胎因基因组甲基化水平下降、甲基化模式紊乱，印记基因表达异常，最终导致胚胎异常发育或死亡，这是由于Dnmt1基因表达的缺失使基因的调节功能遭到破坏，进而破坏了胚胎基因表达的时空特性。

胚胎发育早期，Dnmt3b和Dnmt3a基因特异表达时间不同：Dnmt3b基因特异在胚胎全能干细胞时期表达，以及内细胞团的外胚层细胞中；而Dnmt3a基因在胚胎10.5日龄后广泛表达于各种组织和细胞中。Dnmt3b基因缺失或突变引起的表型异常程度远高于Dnmt3a基因缺失或突变，这可能与两者特异性表达时间不同有关。M.Okano等利用逆转录病毒分别感染Dnmt3a缺失胚胎干细胞、Dnmt3b缺失胚胎干细胞和两种酶都缺失的胚胎干细胞，再通过甲基化敏感酶分析前病毒DNA的甲基化水平，从而反映胚胎干细胞的从头甲基化情况。结果发现，只有Dnmt3a和Dnmt3b中一种DNA甲基转移酶缺失时，胚胎干细胞可使前病毒DNA新发甲基化，而两种酶均缺失的胚胎干细胞则丧失了使前病毒DNA发生从头甲基化的能力。在哺乳动物早期胚胎中也有前述现象发生，说明胚胎干细胞和早期胚胎的从头甲基化需要Dnmt3a、Dnmt3b的共同作用。Dnmt3L高度表达于睾丸和胎盘的绒毛膜，协同Dnmt3家族行使从头甲基化功能。Y.Arakawa等的研究表明，Dnmt3a、Dnmt3b在保持胚胎干细胞和早期胚胎的印记甲基化模式中可能起一定的作用，但不起主要作用；猜测正常甲基化模式的建立需要Dnmt3家族和Dnmt1的共同作用。Dnmt1是Dnmt3家族启动的CpG核苷酸从头甲基化的保证，而Dnmt3家族使甲基化水平提高到正常需要水平。

本试验中，2细胞和4细胞胚胎除Dnmt3a表达量无差异外，其余3种DNA甲基转移酶（Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L）表达量均随年龄增加呈显著下降趋势（＜0.05）；在8细胞／桑椹胚和囊胚中以上4种DNA甲基转移酶表达量均无显著差异（＞0.05）。另外本课题组的前期研究证明，老年鼠8细胞／桑椹胚和囊胚时期胚胎的DNA甲基化水平亦明显低于青年鼠。说明老年鼠胚胎Dnmts表达量下降，导致DNA甲基化模式紊乱。胚胎从8细胞期开始，相关印记基因表达从母源性控制转向胎源性自主调控，老年鼠2细胞和4细胞胚胎Dnmts表达量下降，导致胚胎无法启动正常的胎源性调控功能，这可能使Dnmts表达量异常的胚胎大量死亡，进而表现为老年小鼠的妊娠率和平均产仔数均显著低于青年小鼠，且老年小鼠产出的死胎和畸胎率明显高于青年小鼠。

4 结论

小鼠老化导致2细胞和4细胞胚胎Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L表达量显著下降。