花粉过敏动物模型的研究进展

宋天园，肖 兰，王 甜，夏建珍，鲁碧楠，唐 丽*

（1.民族医药教育部重点实验室（中央民族大学），北京 100081；2.中央民族大学 药学院，北京 100081；3.北京协和医学院 护理学院，北京 100144；4.中央民族大学 附属校医院，北京 100081）

过敏性疾病是一类变态反应性常见病与多发病，呈现出全球高发的趋势，严重影响人们的健康与生活质量，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。已有大量研究表明，致敏性树木和草本的花粉是重要的变应原之一。随着现代社会城市化建设迅速发展，城市绿地建设和生态环境改善的同时，植物种类及种植区域拓展，植物花粉变应原也随之增加，致敏植物花粉 飘散于空气中，是季节性鼻炎、结膜炎、哮喘的触发因素，也是特应性皮炎的加重因素，近年来全球范围内花粉致敏引发的各类变态反应疾病呈现逐年高发态势。因此，对花粉诱发的变态反应性疾病的发病机制、变应原检测、有效治疗及其防控等的探索研究需求日益迫切，花粉过敏动物模型的构建是其中的一个关键因素和环节。依据2013年世界变态反应组织白皮书，全球过敏性疾病的患病率为10% ～40%，其中有过敏性鼻炎患者4亿人和支气管哮喘患者3亿人，开展花粉致敏相关基础和应用研究对保护人类健康、提高人们生活质量具有重要意义。

文章围绕近年来国内外文献报道的花粉过敏动物试验研究，分别从花粉致敏模型动物品系种类、模型构建方法、繁育策略、检测与评价指标等方面进行整理分析，阐述与评价各类动物模型及其构建方法和特点，旨在为花粉过敏动物模型研究的深入开展提供可能的技术参考、为花粉过敏机制研究与有效治疗及药物发现提供一点启发。

1 花粉过敏的类型及其主要发生机制

花粉过敏可引起多种临床症状，花粉变应原可诱发季节性过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎及皮炎等变态反应性疾病，通常主要涉及呼吸系统，出现鼻塞、鼻痒、打喷喷、大量流清水样鼻涕、咽部不适等症状，严重可诱发哮喘，有时非常严重甚至危及生命。

花粉过敏的发生机制复杂，虽然对引起主要病理变化的免疫机制已有所了解，但其免疫病理反应的具体启始途径等环节尚未完全阐明。花粉过敏是由接触变应原花粉而引发的变态反应，在花粉过敏患者血清中同时可检测到特异性IgE和IgG，其中以由IgE介导的Ⅰ型超敏反应（即速发型超敏反应）为主。易感者接触花粉变应原后产生免疫反应，肥大细胞和嗜碱性粒细胞发生脱颗粒现象，生成过量的IgE，并激活释放一系列炎性介质，引发各种过敏反应，致敏机制涉及嗜酸性粒细胞浸润、肥大细胞脱颗粒、抗原特异性IgE产生、Th细胞活化、Th1／Th2失衡等环节，可分为致敏阶段和效应阶段。

T细胞在IgE介导的Ⅰ型过敏反应中发挥重要作用。T细胞表面有多种特异性抗原，其中CD4代表T辅助细胞（helper T cell，Th），当与抗原相遇，Th细胞可分泌细胞因子Th1和Th2。Th1主要分泌白介素（IL）和干扰素（IFN），主要有IL-2、IFN-γ和TNF-α，负责细胞介导的免疫反应。Th2与速发型超敏反应关系密切，主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，能够有效激活B细胞产生IgE抗体。当易感者首次接触花粉变应原后，花粉进入机体并释放出一种复杂的由过敏性和非过敏蛋白质及其他生物活性分子组成的亲水混合物，诱导有利于Th2极化的炎症环境激发抗体反应，变应原选择性激活Th并诱发其分泌细胞因子，使Th2／Th1比例失调，诱导产生IgE抗体。IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞膜表面特定高亲和力受体FcεRI结合，成为致敏靶细胞，使机体处于对该变应原的致敏状态。当机体再次接触相同变应原花粉时，变应原与靶细胞表面的IgE发生特异性结合，肥大细胞与嗜碱性粒细胞被活化并释放组胺、前列腺素和白三烯等血管活性介质，启动Ⅰ型过敏反应的效应阶段。即上述活性介质作用于器官和效应组织，引起局部或全身过敏反应，表现出鼻塞、鼻堵、流涕、打喷嚏等急性炎症症状，继而产生小血管扩张、通透性增加、平滑肌收缩、支气管收缩等变态反应，从而引发过敏反应。

2 花粉过敏动物模型的种类和特点

近年来国内外用于建立过敏动物模型的方法主要是基于使变应原进入机体，与致敏靶细胞上的IgE发生特异性结合而引发变态反应基本原理，模型动物主要采用啮齿类动物，也有少量应用非啮齿类动物模型的研究。由于花粉致敏引发各类变态反应疾病发病机制的复杂性，因此目前还未见某一种动物模型能够完整评价花粉的致敏性及其深入的致敏机制，单独一种动物模型均难以达到探究花粉过敏机制的目的，往往需要依据模型特点、试验目的和具体要求有针对性地选用不同的实验动物来构建相应的过敏模型。

2.1 啮齿类动物

构建花粉致敏动物模型常用的啮齿类动物有小鼠、大鼠、豚鼠和新型动物（如转基因小鼠和人源化小鼠），其中小鼠模型应用最为普遍，各类动物的生理特点各有不同。

2.1.1 小鼠 小鼠具有免疫遗传背景较清楚、品系较纯、来源广等优点，各种不同品系的小鼠具有不同特性。小鼠应用于过敏模型的建立有逐年增加的趋势，常 用 的 品 系 有BALB／c、C57BL／6、C3H／HeJ、BDF-1和KM小鼠等，应根据不同的研究目的选择合适品系的小鼠建立模型。其中BALB／c小鼠属于近交高IgE应答品系，优先产生Th2型免疫应答和IgE抗体，尤其适用于细胞因子水平研究，也可作为筛选潜在蛋白潜在致敏性的有效模型，并且较容易获得，应用最为广泛。文献报道，应用臭椿、桦树、杨树、樟树、雪松、蒿、豚草、苋、葎草、藜、葫芦花和软叶针葵等花粉建立BALB／c品种小鼠致敏模型的相关研究较为丰富，也有采用其他品系小鼠建立豚草和柳树等花粉致敏动物模型的报道。小鼠动物模型的品系种类、构建方法及特点见表1。2.1.2 大鼠 大鼠品系纯、来源广，遗传性状稳定，嗅觉灵敏，对环境中的花粉、粉尘和气体等敏感，易诱发出过敏性鼻炎和哮喘等过敏疾病症状，针对吸入性变应原易产生特异性IgE抗体，从而介导免疫应答，对抗原的反应性较为一致；同时，大鼠的体型比小鼠和豚鼠大，且兼有小鼠和豚鼠模型的优点，更容易对过敏性疾病的典型特征进行有效评价；此外，大鼠的相关分子生物学试剂种类及选择性更丰富，便于获得。目前，常用于制备花粉过敏模型的大鼠品种有SD大鼠和BN大鼠。研究人员应用梧桐花粉和日本雪松花粉成功建立SD大鼠和BN大鼠致敏模型。大鼠动物模型的品系种类、构建方法及特点见表1。

表1 啮齿类动物花粉致敏模型的品系种类、构建方法及特点Tab.1 Species，methods and characteristics of pollen allergic rodent model

续表1

2.1.3 豚鼠 豚鼠具有易感性，对多种变应原具有良好的敏感性，是速发型过敏性呼吸道疾病和过敏性休克的良好动物模型，也是在花粉致敏性预测与

评价中应用的过敏动物模型之一。研究人员应用豚草、艾蒿、杨树和日本雪松花粉成功建立了豚鼠致敏模型，见表1。但是相比于小鼠等实验动物，豚鼠的敏感性过强，个体反应差异大，在利用花粉变应原造模过程中容易出现明显反应甚至死亡；此外用于豚鼠的检测试剂较少，豚鼠Ⅰ型过敏反应预测模型主要靠主观评价进行结果判断，只能定性，不容易定量，容易产生误差；另外豚鼠操作难度较大，特别是注射难度较大，影响因素较多，对结果的客观性容易产生影响。目前采用豚鼠作为过敏模型的研究已呈减少的趋势。

对表1的内容从花粉变应原种类、模型构建方法、优点和不足等特点进行分析，结果提示：遗传背景在诱导花粉过敏模型中起着重要的影响，不同品系的啮齿类动物对花粉变应原多样性存在不同的反应，这与为何只有部分人群对花粉引发过敏反应的情况相似；不同的致敏／激发途径等致敏方式差异在致敏动物模型构建方法中也产生重要影响。研究结果提示相同品系啮齿类动物给予相同的花粉变应原但致敏方式不同，也可能得到不同的模型。

基于上述分析，花粉致敏的啮齿类动物，尤其小鼠模型方法的选择可以依据研究者的目的及条件来合理化地设计实验。一般为了进一步验证或说明实验结果的可靠性，研究者会采用不同动物模型、动物模型和细胞模型结合或是动物或细胞模型与体外其他实验方法结合来完成一个试验目的。例如，朱敬敬等采用BALB／c小鼠和豚鼠2种不同动物模型评价豚草花粉诱导过敏性结膜炎及药物干预作用，说明了不同遗传背景的啮齿类动物模型对研究结果的影响。这些研究结果及其他相关研究结果说明，尽管人类和啮齿类动物（如小鼠）的免疫系统非常相似，但是对于不同物种之间的先天性免疫系统和获得性免疫系统的差异是必须要考虑的，选择不同实验动物及品系、依据其特点建立适合评价花粉过敏反应的动物模型是Ⅰ型过敏反应机制基础研究中关键环节之一。

2.2 非啮齿类动物

迄今建立的花粉诱导的非啮齿类过敏反应模型主要有艾蒿花粉诱导的兔过敏反应模型。其他种类的非啮齿类动物有应用于食物过敏、药物过敏等的研究报道，但是针对花粉过敏的研究极为有限。原因主要是非啮齿类动物的品种差异比啮齿类动物大，各类动物的免疫应答不仅以IgE介导为主，对花粉变应原反应的一致性难于评价，同时也缺乏品种齐全的各类商业性相关免疫试剂，此外非啮齿类动物实验更容易引发伦理及道德争议，故很难将非啮齿类动物应用于花粉致敏性评价及潜在安全性评估中的常规测试。

2.3 新型动物

随着过敏动物模型、基因工程小鼠和人源化小鼠等新型动物模型研究的深入，近年来国外学者逐渐关注应用基因工程小鼠和人源化小鼠等新型动物构建过敏动物模型，其在花粉致敏性评价及过敏机制研究中表现出了一定的优势。

2.3.1 基因工程动物新型模型 基因工程动物的

构建主要是通过插入、敲除或修饰靶基因等基因工程技术方法，改变动物原有基因或者对其基因组加以修饰，从而得到具有特定表型或者表现某些病理特征的动物，是现代基因功能和人类疾病研究中的一类重要动物模型。其中以基因工程小鼠应用最为普遍。普遍采用的基因工程技术主要包括基因敲除或敲入、转基因或定点转基因、基因过表达及人源化等方法。已有研究报道将基因工程小鼠和人源化小鼠模型应用于构建花粉致敏动物模型，这类新型动物模型在一定程度能更有针对性和目的性地表达致敏特征，但是其免疫细胞和相应因子与人类及常规动物相比还存在缺乏系统性改变等问题，仍很难模仿人类花粉症过敏性疾病的主要病理过程。同时该类新型模型的致敏可重复性及构建标准也有待进一步探索。

2.3.2 新型动物繁育策略 目前基因工程动物的构建和繁育多采用129 S和C57BL／6遗传背景小鼠，在应用上既要满足实验目的的需求，同时也要达到繁殖建系的功能要求，因此对一个基因工程动物品系的构建和繁育兼有遗传特性和生存质量两个方面的明确要求，同时也对其具体的繁育策略与技术提出了相应的要求。通常基因工程小鼠基本保留其原有品系背景的生理习性，构建过程的第一代能得到的阳性动物数量普遍很少（多为3～5只），很难满足实验要求，这就需要通过适宜的繁育策略与技术来增加该特定基因型小鼠的数量，一般是通过将构建的基因型小鼠与野生型小鼠交配，再对其进行鉴定，选择其中携带基因突变或特定基因的后代。繁育种鼠的选择：基因工程小鼠繁育生产的目标是快速地繁育且能生产出足够数量的子代小鼠以供筛选，选择繁育种鼠是首要环节，在配繁前，首先需要确认繁育种鼠的遗传背景和基因型，除特殊实验需求之外，一般使用同背景小鼠进行配繁。基因小鼠的种类：近年来国外应用于致敏动物模型研究的基因工程小鼠种类主要有转基因小鼠、KO／KI（knockout／knockin）小鼠、CKO（conditional knockout）小鼠和人源化小鼠。在明确相应的靶基因基础上，采用的繁育技术主要有基于DNA原核显微注射的转基因繁育、基于ES打靶技术构建的KO／KI和CKO繁育、基于CRISPR／Cas 9技术构建的KO／KI和CKO繁育等。经常出现的繁育问题主要包括小鼠打架、小鼠脱毛、雌鼠食仔、品系污染、无法得到纯合子等。

3 花粉过敏动物模型的检测与评价指标

花粉过敏动物模型的评价一般根据动物的整体反应特点和相关指标检测来确定，一般包括症状观察、特异性抗体检测、组织病理形态和辅助检测分析。

3.1 症状观察与评分

花粉过敏动物的过敏反应并不局限在局部，变应性鼻炎、过敏性哮喘及过敏性结膜炎等可视为全身过敏反应的局部表现。症状观察是在对花粉致敏模型动物经抗原激发后进行体征和典型症状观察，时间约30 min，主要通过观察致敏动物的呼吸系统及其他典型症状表现进行评分，总体评价动物过敏反应的程度。如呼吸系统过敏反应症状可观察到小鼠有挠鼻、流涕、打喷嚏等过敏性鼻炎症状，咳嗽、喘息等过敏性哮喘症状，局部可观察到结膜水肿、结膜充血、眼睑肿胀、流泪等过敏性结膜炎症状，阴性表现为无症状，可依据各种症状出现的频次和程度进行评分。通过症状观察与评分可初步判断花粉过敏的程度，但判断可能有一定的主观性和局限性。为增加结果的准确性，一般结合具体、可重复和可定量的实验检测指标进行评价与验证。

3.2 抗体检测及特异性IgE水平测定

花粉导机体产生Ⅰ型过敏反应时，IgE与肥大细胞结合导致肥大细胞脱颗粒，释放多种活性物质，客观定量检测血清中花粉特异性IgE水平是其病理生理机制研究的主要评价指标。一般多应用实验动物血清和酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血清中花粉特异性IgE水平。

3.3 组织病理形态学检测

花粉过敏诱发实验动物发生IgE依赖的过敏反应的局部组织病理变化可通过对动物的鼻黏膜、肺、结膜等组织取材进行检测。一般对组织切片染色后在400倍光学显微镜下观测，检测组织间质有无明显的以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞或中性粒细胞为主的细胞浸润炎症病变、出现水肿渗出及组织间隔增厚等炎症性表现。可采用随机观察或电脑视频计数，对视野中随机200个细胞中嗜酸性粒细胞数、肥大细胞总数和肥大细胞脱颗粒数进行统计，计算肥大细胞脱颗粒百分比。上述检测指标能客观和定量地反映花粉过敏反应的组织炎症性病变和血管通透性增高病理特征。

3.4 其他辅助检测指标

除上述评价指标外，还可以进行免疫细胞相关表型、相关细胞因子种类及浓度水平、外周血抗体和补体水平检测、气道高反应性及过继传输激发实验等辅助评价，主要检测指标有IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）等。细胞因子IL-10和VEGF与Ⅰ型过敏反应特异性抗体IgE密切关联，均由与速发型超敏反应关系密切的Th2细胞所分泌，能有效激活B细胞产生IgE，从而引发效应组织和器官Ⅰ型过敏反应。

4 小结与展望

花粉致敏存在着特异性和不可预测性，不同种类花粉变应原所引发的过敏性疾病表现及其发病机制存在着一定差异，花粉变应原及致敏蛋白种类、花粉吸入途径、遗传特点、免疫状态等因素均与花粉过敏的发生有关，同时由于个体差异的复杂性和多样性，不同个体接触花粉变应原后存在机体的敏感性差异，从而表现出各种不同的临床症状，因此花粉过敏性疾病的种类、病理症状及其表现程度均不尽相同。

尽管近年来花粉致敏动物模型研究已取得了较为丰富的结果，在一定程度上能够较好地揭示相关细胞因子表达、信号通路转导等信息，但是，品种有限的花粉过敏动物模型（主要集中在啮齿类动物模型）和单一的模型构建方式（一般多采用抗原系统性致敏，再随后进行局部激发）仍是目前存在的主要限制因素，在一定程度上制约着对花粉过敏的流行病学、变应原分析、致敏机制和病理发展等方面的深入研究。因此，适宜的花粉过敏动物模型选择和构建是花粉致敏性评价、病理机制和脱敏治疗等研究的重要手段。特征稳定和确切有效的花粉过敏动物模型，可为研究各种花粉变应原的致敏性、揭示花粉过敏疾病的致敏机制及病理过程、评估花粉过敏风险等提供基础，也可为预测各类花粉及其变应原的潜在致敏性提供方法和思路。

目前国内外已有的各类花粉致敏模型各自存在一定的局限性，对各类花粉致敏的动物模型构建和评价方法还有必要进一步加强重复性验证和标准化研究，以使其在花粉致敏性评价及其致敏机制研究中发挥更重要的作用。基因组学和转基因技术等现代生物技术的研究日益深入，一些与变态反应相关的靶基因及其表达调控机制也相应被揭示，为建立有针对性的、稳定高效的花粉过敏新型动物提供了前景，可通过构建特定靶基因调控的花粉过敏新型动物模型，为花粉过敏疾病及其机制研究提供准确的证据。随着信息技术和数据分析平台的发展，通过结合变应原结构信息数据分析，花粉过敏动物模型的选择与构建研究也可为花粉变应原预测及其致敏风险评估提供参考，为花粉过敏性疾病的综合防控提供有效的方法和手段。