基于ddPCR检测荷斯坦牛自由马丁现象的研究

王玉娇，李彦芹，张汝美，蔡高占，赵秀新，顾祥国，李俊婷，姚文龙，李建斌*，仲跻峰*

（1.山东省农业科学院 畜牧兽医研究所，济南 250100；2.山东奥克斯畜牧种业有限公司，济南 250108；3.宁波市牛奶集团有限公司，浙江 宁波 315033；4.宁波市鄞州瞻岐鹰山牛场，浙江 宁波 315145）

自由马丁（freemartinism）综合征是异性双胎牛性器官发育紊乱疾病，主要表现为母牛生殖器官发育不全、雄性化或不育等特征，其主要机制是双胎胚胎早期的尿膜绒毛膜血管之间有吻合支，雄性胎儿分泌的雄性激素会通过吻合支进入雌性胎儿体内，抑制雌性生殖器官的发育。异性双胎对公牛生殖能力的影响尚不确定，然而确有造成生殖能力下降的报道。牛双胎时多达97%胎儿会发生尿膜绒毛膜血管吻合。荷斯坦牛双胎率大约为5%，个别牛群可达10%甚至更高。而且牛的双胎率可能会越来越高，自然会造成自由马丁发生率的增加。

自由马丁初步诊断一般是基于小母牛生殖道的临床检查，以及是否来自双胎或多胎等信息。而确诊需要进行遗传学检查，即确定细胞中是否存在XX／XY嵌合体。细胞遗传学和分子技术可以应用于自由马丁诊断，一般染色体分析是最常见的方法。细胞遗传学鉴定常用的方法包括吉姆萨染色法、染色体分带或性染色体探针荧光原位杂交法等。分子技术主要包括PCR、qPCR或性染色体连锁微卫星标记分型法等。细胞遗传学分析可以精准确定XX和XY细胞比例，但费时费力，而且整个程序涉及无菌采集血液样本、迅速（约24 h内）运到实验室、白细胞培养（48 h或72 h内）、专业人员进行分析等。Y连锁基因的PCR方法比较容易，但不能检测细胞中XX比例较小的XX／XY嵌合体；而且需要增加辅助研究，如其他组织（毛囊、唾液）中微卫星标记的分析等。

微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是第三代PCR，为检测XX／XY嵌合体提供了新的可能性。该方法利用有限稀释和泊松分布可以实现样品中目标核酸的精确定量。ddPCR是一种终点测量方法，可克服传统PCR不能检测低丰度核酸的局限性，并且不需要标准曲线实现目标核心的直接精确绝对定量，法医上已经应用于对混合遗传特征和人类临床嵌合现象的研究，在动物上已用于检测猪白细胞嵌合体。建立快速准确的自由马丁综合征诊断方法对牛的繁育生产有着非常重要的意义。试验对中国荷斯坦母牛的异性孪生母犊进行ddPCR检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

13～15月龄中国荷斯坦母牛7头，来源于山东省某牛场。母牛个体发育与同群其他个体没有明显差异，因为配种5次以上未孕，进行了直肠检查，发现存在子宫小、单子宫角等子宫发育不全特征。经与技术人员沟通，这些母牛可能是异性双胎中的母犊。为鉴定是否为自由马丁综合征，每头牛尾静脉采集外周血10 mL于抗凝管中，-20℃保存，备用。

1.2 主要试剂和仪器设备

血液基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；ddPCRSupermix for Probes、微滴生成油，Bio-Rad公司产品。

离心机（型号为iCEN-24R），杭州奥盛仪器有限公司；分光光度计（型号为NanoDrop 8000 Micro），赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；QX200数字PCR仪、PX1热封仪，Bio-Rad公司产品。以上试剂和仪器均来源于山东省农业科学院畜牧兽医研究所实验室。

1.3 DNA的提取

使用血液基因组DNA提取试剂盒严格按照说明书步骤提取DNA，用分光光度计测定提取后的DNA浓度，保证DNA浓度在10 ng／μL以上。

1.4 引物和探针设计

哺乳动物中AMEL基因定位于性染色体上，该基因在不同性染色体中存在独立进化的特征，AMEL基因在X染色体（AMEL-X）和Y染色体（AMELY）以不完全一致的形式存在，AMEL基因这一特性非常适合作为X和Y染色体区分的靶标基因。通过ddPCR技术鉴定AMEL-X和AMEL-Y基因拷贝数估算X和Y染色体的拷贝数。参考相关文献及NCBI的引物序列，设计ddPCR的靶标基因引物和探针。序列如下：AMEL-X正向引物，5′-CATGCAGCCCTTGCA-3′；AMEL-X 反 向 引 物，5′-ATATCGGAGGCAGAGGT-3′；AMEL-Y正向引物，5′-ACCAACCCCTGCAG-3′；AMEL-Y反向引物，5′-TGCATGGGGAATATTGGAG-3′；AMEL-X 探针 （HEX），HEX -CAGCCCTTGCCGC-BHQ1；AMEL-Y探针（FAM），FAM-CAGCGCTTGCCACCBHQ1。

1.5 ddPCR反应体系及反应条件

1）将ddPCRSupermix for Probes（No dUTP）在室温下融解，上下颠倒混匀，12 000 r／min离心2 min。

2）配制ddPCR Reaction Mix，反应体系见表1。

表1 dd PCR反应体系Tab.1 dd PCR reaction system

3）配好的反应体系振荡混匀，12 000 r／min离心2 min后，小心地转移到微滴发生卡中间一排的样品孔内，并在下排孔中加入70μL微滴发生油，然后在微滴生成仪中生成微滴。

4）将生成好微滴的样品40μL从微滴发生卡的上排孔中转移到ddPCR专用孔板中，盖上铝膜后用PX1热封仪对孔板进行封膜。

5）PCR反应条件见表2。

表2 PCR反应条件Tab.2 PCR reaction conditions

6）PCR结束后，将孔板取出，在微滴读取仪上进行微滴读取。

7）微滴读取结束后，在Bio-Rad QuantaSoft软件上分析数据结果。

1.6 测定项目

测定AMEL-X的一维液滴分布、AMEL-Y的一维液滴分布及AMEL-X和AMEL-Y基因拷贝数，并计算AMEL-Y／AMEL-X。

2 结果与分析

本试验为单通道试验，在只加入AMEL-X探针样本测定时使用通道2（见图1），只加入AMEL-Y探针样本时使用通道1（见图2）。图1中绿色的是阳性液滴，含有可扩增模板（AMEL-X片段）的液滴；灰色的是阴性液滴，不含有可扩增模板的液滴。阳性液滴为6 876，阴性液滴为107 249，其中A05、C05、D05、E05、F05、B06、C06为只加入AMEL-X探针的样本1～7。图2中蓝色的是阳性液滴，含有可扩增模板（AMEL-Y片段）的液滴；灰色的为阴性液滴，不含有可扩增模板的液滴。阳性液滴为3 253，阴性液滴为106 866，其中A07、C07、D07、E07、F07、F06、G06为只加入AMEL-Y探针的样本1～7。图1和图2中的阴性液滴和阳性液滴明显分成两簇，表明试验结果良好。根据阴性液滴和阳性液滴的比例可以得出ddPCR反应中可扩增模板的拷贝数，见图3。测得样本1～7的AMEL-X和AMEL-Y的基因拷贝 数 分 别 为147 copies／μL 和62 copies／μL，99 copies／μL和22.3 copies／μL，60.4 copies／μL和17.8 copies／μL，27.3 copies／μL和24.6 copies／μL，97 copies／μL和71.9 copies／μL，65.2 copies／μL和34.8 copies／μL，36.6 copies／μL和17.9 copies／μL。根据ddPCR测定的浓度推算出原样本的基因浓度见表3。计算得出这7个原样本中AMEL-X拷贝数浓度范围为273 ～1 470 copies／μL，AMEL-Y拷贝数浓度范围为178 ～719 copies／μL；以此计算，得出AMEL-Y基因浓度与AMEL-X基因浓度的比例范围为0.23～0.90。这说明试验检测的7头母牛血液样本中均含有Y染色体，为XX／XY嵌合体，可以判定为异性孪生母犊不孕的个体。该结果与母牛直肠检查结果一致。

表3 ddPCR定量结果Tab.3 ddPCR quantitative results

图1 AMEL-X的一维液滴分布图Fig.1 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-X

图2 AMEL-Y的一维液滴分布图Fig.2 One-dimensional droplet distribution map of AMEL-Y

图3 AMEL-X和AMEL-Y基因拷贝数Fig.3 AMEL-X and AMEL-Y gene copy numbers

3 讨论

一般情况下，异性孪生母牛在性成熟前与正常个体发育相似，但在性成熟后表现与正常母牛不同，体型和公牛相似，头和角都变得粗大，哞叫声也像公牛，性情粗暴，乳房极不发达，子宫和卵巢发育不全，但如果不仔细观察很难发现。尤其在大型规模化牧场更难发现，只有到配种时发现屡配不孕，进一步检查时方能检查。

先前有研究者对异性孪生母犊不孕个体中的染色体进行研究，发现异性孪生母犊的染色体有XX、XXY、XY等组型，正常母犊个体的染色体应该为XX组型，因此在孪生母牛样本中检测到Y染色体就可以判定为异性孪生不孕个体。也有研究表明，XX／XY嵌合体的公牛睾丸发育不全。

基于时间和成本及检测准确度、灵敏度方面的考虑，ddPCR技术是一个有效的检测XX／XY嵌合体的方法。ddPCR检测嵌合体的方法曾应用于猪等动物。ddPCR是第三代PCR技术，是一种终点测量方法，无需使用标准曲线即可进行定量，通过与X和Y染色体相关联的基因可以对染色体拷贝数进行定量。在哺乳动物中高度保守的AMEL基因恰好满足这个要求，AMEL基因在X和Y染色体上均表达但并不完全一致，AMEL基因已用于绵羊、水牛等多种哺乳动物的性别鉴定。

I.Szczerbal等为了评判ddPCR在检测牛XX／XY染色体嵌合方面的特异性，按比例稀释雌性（XX）DNA与雄性（XY）DNA混合样本，利用ddPCR进行检测，结果表明，ddPCR可以检测到XX（98%）／XY（2%）到XX（4%）／XY（96%）比例的混合样本。证明ddPCR技术在检测牛XX／XY染色体嵌合方面可以达到较高的准确性，并且检测结果与细胞遗传学检测结果相符。本试验中，基因浓度的比例范围为0.23～0.90。

4 结论

在本试验中，选择ddPCR方法对7头中国荷斯坦异性孪生双胎的母牛外周血进行鉴定，并根据异性孪生母犊不孕的个体染色体为XX／XY嵌合、正常母牛染色体为XX来判定是否为嵌合体。结果表明，此7个样本均存在XX／XY染色体嵌合，均为异性孪生不孕母犊。