抗氧化和降胆固醇双活性大麦若叶代餐羊酵乳的研制

白璐，王爽，秦鑫莹，祝子翔，郑可欣*，岳喜庆*

沈阳农业大学 食品学院（沈阳 110866）

人体内由自由基或活性氧引起的过氧化反应虽然具有抗病等必要功能，但是当它超出限度或在不当部位发生时即成为某些疾病的致病因子[1-3]，同样，人体内的胆固醇是维持人体机能的必要组分，但是过高的胆固醇含量将引起动脉硬化和血栓等疾病[4-5]。因此，两者都需要适当控制，而通过饮食控制机体内过氧化反应和胆固醇含量是最理想的方式。

大麦若叶为大麦生长到15～30 cm的幼苗[6]，富含微量元素、叶绿素、类黄酮、维生素、膳食纤维、多糖、蛋白质及抗氧化酶等多种功能营养成分[7-9]。近年来的研究表明，大麦若叶青汁不仅具有润肠通便的功效，还具有较强的抗氧化和降胆固醇能力[8-9]，是新兴的健康食材。

羊乳中乳清蛋白与酪蛋白的比例显著高于牛乳，在胃内形成结构细小且松散的絮状软凝块，易于被消化吸收，且羊乳含有少量的乳糖，与牛乳制品相比更适于乳糖酶缺乏的人群，显著降低乳糖不耐受症状[10-11]。大量研究还表明，羊乳中的乳清蛋白及其降解形成的生物活性肽具有良好的调节血糖功能[12]。以羊乳为原料制成发酵乳，既能保留羊乳的营养成分，又增强其易被消化吸收的能力，更适宜乳糖不耐受人群[13-14]和2型糖尿病患者[12]。

研究以羊酵乳和大麦若叶粉为主，添加大麦若叶多糖、青稞、木薯粉、木糖醇和甜菊苷，制备具有抗氧化和降胆固醇的双功能新型代餐羊酵乳。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯山羊奶（弗里生天津乳制品有限公司）；大麦种子（寿禾种业）；木糖醇（郑州市伟丰生物科技有限公司）；甜菊苷（郑州市伟丰生物科技有限公司）；青稞（陕西北三禾食品有限公司）；木薯粉（海宁枫园食品有限公司）；酸奶发酵剂（尚川，10株菌型，广东顺德尚川科技有限公司）；无水乙醇（国药，Cat#10009218）；正丁醇（西陇科学，Cat#71-36-3）；氯仿（阿拉丁，Cat# 865-49-6）；PBS磷酸盐缓冲液（Solarbio，Cat#P1010）；邻苯二甲醛（阿拉丁，Cat#643-79-8）；冰乙酸（国药，Cat#64-19-7）；浓硫酸（国药，Cat#7664-93-9）；新鲜鸡蛋黄、胆固醇标准品（Merck，Cat#57-88-5）；考马斯亮蓝法蛋白浓度测定试剂盒（Mbchem，Cat#M2031）；总抗氧化能力检测试剂盒（碧云天，Cat#S0119）。

1.2 仪器与设备

电子天平（岛津AUW220D）；超净工作台（Thermo ScientificTMHeraguardTMECO 51029704）；低温干燥机（双嘉SJIA-10N-50C）；粉碎机（康和机械WF130）；超声波细胞粉碎机（比朗BILON-1200Y）；恒温水浴锅（聚创世纪HH-6）；离心机（Thermo ScientificTMSorvall ST8R）；电磁炉（美的WH2202）；电热恒温培养箱（上海精宏DNP-9272）；pH计（上海雷磁PHS-3E）；冰箱（美菱YC-395L）；紫外分光光度计（Thermo Varioskan LUX）。

1.3 方法

1.3.1 大麦若叶代餐羊酵乳制作的工艺流程

市售生羊乳经巴氏杀菌后发酵获得发酵乳，加入大麦若叶粉、大麦若叶多糖、木糖醇、甜菊苷和青稞木薯圆子，得到大麦若叶代餐羊酵乳产品，制备工艺流程如图1所示。青稞木薯圆子由青稞搭配木薯粉和大麦若叶粉制备，用以提升产品咀嚼感和饱腹感。

图1 大麦若叶代餐羊酵乳制作的工艺流程

1.3.2 操作要点

1) 大麦若叶粉制备：大麦种子在40 ℃温水中浸泡24 h，挑除坏种后，均匀平铺在加密盘上，覆盖一张湿润的育苗纸，放入培养箱。培养箱的培养条件：白天温度（27±1）℃，晚上温度（18±1）℃，光照时间16 h/d，光照强度2 000 Lx，湿度70%。保持每日喷水4～6次，等到种子长出1 cm的绿芽后揭开育苗纸，并在加密盘底部倒入蒸馏水，水位保持（3±0.1）cm。待麦苗长到20～30 cm进行收割，选取上端的大麦嫩叶，剔除虫病害及污染的部分，用纯净水浸泡4～6 min，冲洗3次以上，去除灰尘及其他杂物，切成短杆状（2 cm），用棉纸吸除表面水；称取300 g大麦苗，以2 ℃/min的速度快速冷冻至-20 ℃，冷冻干燥微波功率设定为400 W，压力设定为50 Pa，保持冷阱温度在-40 ℃，干燥时间60 min。将冷冻的大麦苗用粉碎机粉碎（10 kW，10 min），经实验筛网超细过滤得0.013 mm大麦若叶粉。

2) 大麦若叶多糖提取：称取5.00 g大麦若叶粉，按照料液比1∶30 g/mL加入蒸馏水，超声粉碎30 min，于70 ℃水浴加热2 h，离心取上层清液，按照体积比3∶16加入乙醇（体积分数95%），冷藏12 h进行醇沉。采用Sevage法（V正丁醇∶V氯仿=4∶1）除蛋白，透析冻干得大麦若叶多糖。

3) 青稞木薯圆子制备：将青稞粒用纯净水浸泡5 h，在100 ℃沸水中煮4 h，冷却至室温后备用。取30 g木糖醇溶于清水（质量比为1∶5），熬煮至黏稠状糖浆；取20 g大麦若叶粉、100 g木薯粉（可酌情适量增减）加入糖浆中，充分搅拌揉搓成面团，切分并压成薄皮（0.3 g/个），每皮包裹一粒熟青稞，揉圆（直径约7 mm）；于-18 ℃冷藏保存；制备成品前取青稞木薯圆子于沸水中煮15～20 min。

4) 羊酵乳的制备：生羊乳经巴氏杀菌并冷却至室温后，加入酸奶发酵剂（质量比为1∶500），充分搅拌，于42 ℃恒温发酵10 h，室温自然冷却至10 ℃，放入4 ℃冰箱后熟12 h。

5) 大麦若叶代餐羊酵乳成品的制备：向羊酵乳中加入大麦若叶粉、大麦若叶多糖、木糖醇和甜菊苷后，充分搅拌，加入青稞木薯圆子即得到成品。

1.3.3 大麦若叶代餐羊酵乳组分的单因素试验

用单因素试验确定大麦若叶代餐羊酵乳的5个组分（因素），即大麦若叶粉、大麦若叶多糖、发酵菌接种量、木糖醇、青稞木薯圆子的适当添加数量，评价的方法为感官评定。

1) 大麦若叶粉添加量试验：大麦若叶粉添加量分别为0.6，0.8，1.0和1.2 g/100 mL。不变组分为大麦若叶多糖添加量0.7 mg/mL、发酵菌接种量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量15%。

2) 大麦若叶多糖添加量试验：大麦若叶多糖添加量分别为0.3，0.5，0.7和0.9 mg/mL。不变组分为大麦若叶粉添加量0.8 g/100 mL、发酵菌接种量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量15%。

3) 发酵菌接种量试验：发酵菌接种量分别为0.15，0.20，0.25和0.30 g/100 mL。不变组分为大麦若叶粉添加量0.8 g/100 mL、大麦若叶多糖添加量0.7 mg/mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量15%。

4) 木糖醇添加量试验：木糖醇添加量分别为3.0，3.2，3.4和3.6 g/100 mL。不变组分为大麦若叶粉添加量0.8 g/100 mL，大麦若叶多糖添加量0.7 mg/mL，发酵菌接种量0.2 g/100 mL，青稞木薯圆子添加量15%。

5) 青稞木薯圆子添加量试验：青稞木薯圆子添加量分别为5%，10%，15%和20%。不变组分为大麦若叶粉添加量0.8 g/100 mL、大麦若叶多糖添加量0.7 mg/mL、发酵菌接种量0.2 g/100 mL、木糖醇添加量3.4 g/100 mL。

1.3.4 大麦若叶代餐羊酵乳组分的正交试验

根据单因素试验确定的大麦若叶代餐羊酵乳5个组分的数量范围，进行大麦若叶粉添加量（A）、大麦若叶多糖添加量（B）、发酵菌接种量（C）、木糖醇添加量（D）、青稞木薯圆子添加量（E）这5个因素4个水平的正交试验，即按L16(45)进行正交设计（表1），通过感官评价，进行产品配方的优化。

表1 大麦若叶代餐羊酵乳组分优化正交试验的因素和水平

1.3.5 产品的感官评定

选择40名（男20名，女20名）评审人员组成感官评定小组，全部人员无不良生活习惯，无消化系统和内分泌系统疾病，一个月内没有节食减肥及服用任何药物。评审人员禁食5 h后饮用250 mL产品，15 min内进食完毕，分别从色泽、气味、组织状态、口感、饱腹感程度五个方面对大麦若叶代餐羊酵乳进行感官评分，评分标准如表2所示。

表2 感官评分指标

1.3.6 pH测定

用pH计测定产品pH。

1.3.7 抗氧化活性测定

以羊酵乳和纯化大麦若叶多糖为对照组，以最优配方产品为试验组，分别取1 mL溶于等体积磷酸盐缓冲液（PBS）作为原液，依次进行2，4，8，16和32倍稀释，利用总抗氧化能力试剂盒（ABTS法）进行抗氧化能力检测。

1.3.8 降胆固醇活性测定

以羊酵乳为对照组，以最优配方产品为试验组，分别取2 mL，调节pH至2.0，于4 000 r/min离心20 min，取0.04 mL上清液，利用邻苯二甲醛吸附法测定胆固醇吸附量。计算公式：胆固醇吸附量（mg/g）=（吸附前蛋黄液中胆固醇含量-吸附后蛋黄液中胆固醇含量）/样品质量。

2 结果与分析

2.1 大麦若叶代餐羊酵乳组分含量变化对感官评定的影响

2.1.1 大麦若叶粉添加量的影响

大麦若叶粉添加量对产品色泽、气味和口感有较大影响。如图2所示：当大麦若叶粉添加量为0.60 g/100 mL时，大麦若叶气味浅淡，产品呈乳白色；添加量为0.80 g/100 mL时产品感官评分最高，产品呈浅绿色且色泽均匀，具有清新的大麦若叶香气，口感细腻；而当添加量为1.00 g/100 mL时，大麦若叶气味较浓且掩盖住奶香味，口感略粗糙；当添加量为1.20 g/100 mL时产品整体呈墨绿色，出现沉淀，口味略苦。结果表明，当大麦若叶多糖添加量为0.7 mg/mL、发酵菌接种量为0.2 g/100 mL、木糖醇添加量为3.4 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量为15%时，大麦若叶粉最适添加量为0.80 g/100 mL。

图2 大麦若叶粉添加量对产品感官评定的影响

2.1.2 大麦若叶多糖添加量的影响

大麦若叶多糖添加量对产品感官评定略有影响。如图3所示：当大麦若叶多糖添加量为0.70 mg/mL时，产品感官评分最高，此时产品色泽均一，质地均匀浓稠；当添加量高于0.70 mg/mL时，产品与多糖溶解度下降，出现结块和分层现象，感官评分降低。结果表明，当大麦若叶粉添加量为0.8 g/100 mL、发酵菌接种量为0.2 g/100 mL、木糖醇添加量为3.4 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量为15%时，大麦若叶多糖最适添加量为0.7 mg/mL。

图3 大麦若叶多糖添加量对产品感官评定的影响

2.1.3 发酵菌接种量的影响

发酵菌接种量对产品组织状态、气味和口感有较大影响。如图4所示：发酵菌接种量为0.20 g/100 mL时，产品感官评分最高，此时产品质地均匀，细腻黏稠，无分层结块和乳清析出，酸度适宜；当接种量低于0.20 g/100 mL时，产品发酵不完全，出现分层现象，口感较差；当接种量高于0.20 g/100 mL时，产品乳清析出量明显增多且有絮状物生成，酸度增加，感官评分降低。结果表明，当大麦若叶粉添加量为0.8 g/100 mL、大麦若叶多糖添加量为0.7 mg/mL、木糖醇添加量为3.4 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量为15%时，发酵菌最适接种量为0.20 g/100 mL。

图4 发酵菌接种量对产品感官评定的影响

2.1.4 木糖醇添加量的影响

木糖醇添加量对产品口感有较大影响。如图5所示：木糖醇添加量为3.40 g/100 mL时产品甜度适宜；随着木糖醇添加量降低，产品酸度提升，口感下降；随着木糖醇添加量逐渐提高，产品甜度急剧上升，甜腻感严重影响产品品质。结果表明，当大麦若叶粉添加量为0.8 g/100 mL、大麦若叶多糖添加量为0.7 mg/mL、发酵菌接种量为0.2 g/100 mL、青稞木薯圆子添加量为15%时，木糖醇最适添加量为3.40 g/100 mL。

图5 木糖醇添加量对产品感官评定的影响

2.1.5 青稞木薯圆子添加量的影响

青稞木薯圆子添加量对产品饱腹感有较大影响。如图6所示：当青稞木薯圆子添加量为15%时，产品饱腹感最强且饱腹程度适宜，该比例对酸奶本身口感无影响，但较强地增加了评价者的咀嚼感及饮用趣味；随添加量降低，评价者饱腹感程度呈明显下降趋势；当添加量大于15%时，部分评价者开始出现咀嚼困难和胃部饱胀的情况。结果表明，当大麦若叶粉添加量为0.8 g/100 mL、大麦若叶多糖添加量为0.7 mg/mL、发酵菌接种量为0.2 g/100 mL、木糖醇添加量为3.4 g/100 mL时，青稞木薯圆子最适添加量为15%。

图6 青稞木薯圆子添加量对产品感官评定的影响

2.2 大麦若叶代餐羊酵乳配方优化试验结果

大麦若叶粉添加量（A）、大麦若叶多糖添加量（B）、发酵菌接种量（C）、木糖醇添加量（D）和青稞木薯圆子添加量（E）的5个因素4个水平的正交试验结果如表3所示。在5个因素中，影响大麦若叶代餐羊酵乳感官品质的次序为大麦若叶粉添加量（A）＞木糖醇添加量（D）＞发酵菌接种量（C）＞青稞木薯圆子添加量（E）＞大麦若叶多糖添加量（B）。产品最优生产工艺为A2B3C2D3E3，即大麦若叶粉添加量0.8 g/100 mL，木糖醇添加量3.4 g/100 mL，发酵菌接种量0.2 g/100 mL，青稞木薯圆子添加量15%，大麦若叶多糖添加量0.70 mg/mL。按照最优组合制备的大麦若叶代餐羊酵乳产品的感官评分95分，显著高于其他组合。

表3 正交试验结果

2.3 大麦若叶代餐羊酵乳的抗氧化活性

2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）在氧化剂作用下被氧化成绿色的ABTS+自由基，测定体系在734 nm处的吸光度；当体系中存在抗氧化剂时，能够抑制该氧化反应的发生，并降低反应体系在734 nm处的吸光度[15]。试验以Trolox（1 mmol/L）溶液为标准抗氧化剂，比对检测纯羊酵乳、大麦若叶多糖及大麦若叶代餐羊酵乳的抗氧化能力，结果如图7所示。纯羊酵乳抗氧化能力较低，仅为1.99±0.014 mmol/L Trolox，纯化大麦若叶多糖抗氧化能力为2.475±0.035 mmol/L Trolox，显著高于纯羊酵乳（p＜0.005）。大麦若叶青汁代餐羊酵乳的抗氧化能力为2.41±0.014 mmol/L Trolox，与纯化大麦若叶多糖相近，显著高于纯羊酵乳（p＜0.005）。这个结果说明大麦若叶代餐羊酵乳具有较强的抗氧化能力。

图7 大麦若叶代餐羊酵乳的抗氧化能力

2.4 大麦若叶代餐羊酵乳的降胆固醇活性

在浓硫酸的作用下，邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）上的醛基（—CHO）能与胆固醇的C3位上的羟基（—OH）相互吸附产生紫红色物质，在波长550 nm处有最大吸光度[16]，当体系中存在胆固醇吸附物质时，OPA与胆固醇形成的紫色物质减少，降低在550 nm处的吸光度。因此，OPA可用于检测反应体系中的胆固醇含量。研究中，以新鲜鸡蛋黄液为胆固醇供体，经纯羊酵乳和大麦若叶代餐羊酵乳分别吸附后，用OPA检测体系中的胆固醇含量变化，结果如图8所示。纯羊酵乳对胆固醇吸附量较低，仅为1.35±0.212 mg/g，大麦若叶代餐羊酵乳的胆固醇吸附量为2.5±0.141 mg/g，显著高于纯羊酵乳（p＜0.000 5）。这个结果表明，大麦若叶代餐羊酵乳比纯羊酵乳具有更强的胆固醇吸附能力。

图8 大麦若叶代餐羊酵乳的降胆固醇活性

3 结论

根据单因素试验和正交试验结果综合分析得出，大麦若叶代餐羊酵乳最优配方为大麦若叶粉添加量0.8 g/100 mL，大麦若叶多糖添加量0.70 mg/mL，木糖醇添加量3.4 g/100 mL，甜菊苷添加量0.01 g/100 mL，混合发酵菌接种量0.2 g/100 mL，青稞木薯圆子添加量15%。原奶经巴氏杀菌后发酵调配，发酵时长10 h，加入其他组分后，乳酸菌数≥109CFU/mL，未检出大肠杆菌，符合GB 19302—2010《发酵乳》[17]。该产品不仅含有丰富的乳蛋白，还具有抗氧化和降胆固醇的双活性，且不影响产品的品质。大麦若叶代餐羊酵乳的研制丰富了羊乳加工食品和代餐产品种类，扩展了大麦若叶的用途，同时为抗氧化和降胆固醇功能性食品的研发提供了新思路。