基于PCR检测技术鉴别羊肉掺假的研究进展

项爱丽，段晓然，梅汝蕃，汤思凝，郑百芹*，王秋悦*

1. 唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2. 河北科技师范学院动物科技学院/河北省预防兽医重点实验室（秦皇岛 066000）

随着社会经济的发展、人民生活水平的提高、食品工业的现代化及动物优质食品生产的需求，肉类掺假问题逐渐受到社会各方面的广泛关注。

鉴别肉类掺假的方法有很多种，有基于形态学检测、代谢物检测、蛋白质检测[1-6]、核酸检测等方法。感官鉴定在一定程度上会产生主观差异，只能作为初步判别。组织学鉴定及显微镜检查，仅能做出初步的定性检测，不能做出定量判断。光谱法、质谱法对实验操作要求较高，操作繁琐，因此其应用于肉制品掺假鉴定也日益减少。电子鼻、电子舌等技术可通过羊肉的组织结构及其特殊的气味鉴别羊肉的真伪，但也仅能做出定性鉴别，不能定量。色谱技术和电泳技术可以有效分离和鉴别肉类制品中的各种成分，在实践中有参考价值，但操作繁琐且相对昂贵、费时，不便日常样品分析。免疫学方法由于蛋白质的热稳定性较弱，加热过程中蛋白质会发生变性，导致免疫学方法在肉类掺假检测方面也存在一定局限性。

基于核酸检测技术的PCR检测方法对掺假鉴定比较成熟，这种鉴别方法最为权威，具有灵敏度高、重现性好、稳定性高、用时短等优点，因而在羊肉掺假检测方面得到广泛应用。主要对基于核酸检测技术的几种常用的PCR检测方法对羊肉制品掺假检测进行介绍。

1 掺假羊肉及肉制品基于核酸检测技术的PCR检测方法

1.1 普通PCR

普通PCR技术在食品领域最早被用于有害微生物的检测。郭凤柳等[7]使用该方法对5种动物进行肉源成分的检测，其中采集的羊肉样品共56份，掺假率达75%，结果显示检测浓度可达到pg，甚至部分可达fg。Bhat等[8]针对线粒体cytB设计引物，采用多重PCR方法对羊肉中2种肉类（牛肉、水牛肉）掺假进行鉴别，设计多重PCR方法进行检测，试验中使用优化好的反应条件以及反应体系进行PCR，得到了预期效果，熟羊肉的比例从20%降低到1%，其条带亮度与纯羊肉相似。在混合肉样中，牛和水牛cyt B基因片段的条带强度随着其在熟羊肉Rista中的比例从20%下降到1%而呈进行性下降。但仍可以准确检测，羊肉掺假鉴别检测限低至1%（W/W）。Jia等[9]基于线粒体16S rRNA设计一对通用引物，采用多重PCR方法对羊肉掺假分子进行鉴定，成功鉴别出混合肉中的各种类肉成分，同时为了检测混合比例对检测结果的影响，进行不同比例混合肉的检验，均能准确地检测出其肉源成分。Nagappa等[10]针对羊的线粒体D环的一个独特靶区设计引物，采用高度种属PCR的方法对羊肉进行掺假鉴别，对生的以及不同程度热处理的羊肉进行PCR检测，在不高于121 ℃的高温下，均可在羊肉中提取出理想的DNA，此外，该方法的灵敏度为0.1%，绵羊DNA的检测限低至1 pg。普通PCR灵敏度高，特异性强，但相对耗时较长，因反应不是在闭管内进行的，还存在一定的污染概率。

1.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术实际是对核酸的定量，实时荧光定量PCR主要包括Taq和SYBR Green两大类。通过向反应体系中加入荧光基团，在PCR指数扩增过程中连续监测荧光信号，实时监测特异性产物的数量，通过目的基因的标准曲线进行定量分析[11]。凌睿等[12]以MY为通用引物，利用SYBR Green实时PCR方法对市场中常见的肉类（猪、牛、山羊、绵羊、鸭、鸡）进行DNA提取检测，成功地检测出各肉类DNA，并对含1%猪肉的模拟样品掺假羊肉类进行检测，猪肉的检出限为0.1 ng，对含有0.1%羊肉的模拟样品掺假猪肉进行检测，亦可检出羊肉成分，其检出限为0.01 ng。顾文佳等[13]以羊的线粒体细胞色素B基因为特异性基因，以12S rRNA为内掺基因，采用荧光定量PCR检测冷冻羊肉卷中羊肉的相对含量，同时与称重法进行了比较。徐瑗聪等[14]以线粒体细胞色素B基因为靶基因，采用实时荧光定量PCR对猪、牛、羊肉的掺假情况进行检测，成功检测出火腿肠、牛肉粒、绵羊肉泡馍中的猪肉、牛肉、羊肉成分，对猪、牛、羊3种肉类的最低检出限分别为5，5和50 pg，其对应的拷贝数分别约1.69，1.52和17.5。刘国强等[15]通过探针法对鸭源性掺假进行检测，可检出含1%的鸭肉与羊肉混合物中的鸭源成分，对鸭源成分检测限可达10 fg。荧光定量PCR，自动化程度高，特异性强，灵敏度高，具有实时性及高定性、定量判断[16]。但实时荧光定量操作要求严格，价格相较普通PCR昂贵。

1.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）方法是一种在等温温度下扩增靶DNA的新方法。该方法依赖于4个特异性引物——内引物（FIP和BIP）和外引物（F3和B3），识别靶DNA的6个不同区域[17]。也可以通过向反应混合物中加入SYBR Green I染料目视测定LAMP反应，在存在LAMP扩增子的情况下，溶液的颜色变为绿色，但在无扩增的混合物中保持橙色[18]。目前LAMP已被用于检测细菌、病毒、寄生虫和转基因生物等研究中。陈珍金等[19]以大鼠线粒体COX基因KP244683.1及小鼠16S rRNA 基因KY018919.1为靶基因设计相应的特异性引物，首次通过LAMP法进行羊肉制品中鼠源性成分鉴定检测，成功检测出羊肉串、羊肉卷中的鼠源性成分，检出率达100%，并对检出限进行检测，大鼠检出限达0.1%（W/W），小鼠检出限达0.5%（W/W）。邵长春等[20]以猪ND1、牛COXI、羊cytB为靶基因设计特异性引物，通过LAMP检测猪牛羊源性成分，结果表明猪、羊、牛源性成分的检出限为0.01%（W/W），猪、羊源性成分检测灵敏度为10 pg，牛源性成分检测灵敏度为1 pg。柳海宾等[21]以鸭cytB为靶基因设计特异性引物，将LAMP与免疫层析试纸条（ICTS）技术相结合，检出限为0.01%（W/W），用LAMP-ICTS方法检测的市售样品羊肉中鸭源性成分的结果与行业标准方法检测出的结果一致，且LAMPICTS检测方法可在40 min内检测出结果。LAMP方法有显著的灵敏度高、特异性、快速和易于操作的优点，使DNA在等温条件下有效扩增，无需复杂、昂贵的热循环仪和信号检测的后扩增程序[22]，检测限可达到几个拷贝。但环节等温扩增技术需要设计较多的引物，操作相对复杂。

1.4 数字PCR技术

数字PCR（digital PCR，dPCR）是近20年兴起的第3代PCR技术。它是根据传统PCR原理与泊松统计分布（Poisson distribution）设计的新型PCR技术[23]。陈传君等[24]以羊、牛单烤贝生长激素基因GH为特异性基因设计特异性引物和探针，采用微滴式数字PCR方法检测羊等肉制品中的鸭源性成分，通过向样品中添加牛肉作为内标，通过DNA拷贝数与质量间的线性关系，实现拷贝数与质量间的转换。羊肉成分为0.01时，拷贝数可达0.12 copies/μL。能够检测出样品中含有5%以上的羊源性成分。陈晨等[25]根据羊和猪的单烤贝基因设计引物与探针，验证肉的质量与DNA浓度及DNA拷贝数之间的线性关系，建立检测肉制品中猪源及羊源性成分含量的鉴别方法，通过检测肉制品中羊肉以及猪肉的拷贝数即可推断出肉的质量。王珊等[26]通过3份羊肉制品检测对比微滴式数字PCR与荧光定量PCR的检测方法的优缺点，荧光定量方法通过Ct值来粗略判断DNA的含量，微滴式数字PCR方法通过检测出的拷贝数计算出羊源及猪源性成分含量。数字PCR特异性强、灵敏度高、耗时短，检测限可达到拷贝数级别。但操作复杂，且需要昂贵的仪器及探针。

1.5 限制性片段长度多态性方法

限制性片段长度多态性-PCR（PCR-RFLP）是一种用特异性内切酶将PCR扩增产物切割成不同大小的片段，得到解析图谱的鉴定方法。PCR-RFLP在成本、检测能力、适用性等方面被视为最高效的方法之一。Kumar等[27]以cytB为目的基因设计一对特异性正反向引物，使用PCR-RFLP检测法，鉴别5种常见食用动物的肉类。用AluI和TaqI限制性内切酶消化扩增的目的片段，鉴定样品中的水牛肉、牛肉、绵羊肉、山羊肉和猪肉成分，限制性内切酶AluI在绵羊中得到大小为259和350 bp的2个片段，但不能裂解山羊PCR产物。TaqI限制性内切酶在山羊中得到大小为43，131，163和272 bp的4个片段，且每个种属的AluI和TaqI独特限制性酶切模式都可很好地鉴定所有5种食用动物种属，但其耗时较长，几乎需要24 h。Mahajan等[28]根据MT 12S rRNA基因作为靶标设计通用引物，对不同混合比例的水牛、牛、绵羊、山羊肉进行检测，仅用AluI限制性内切酶消化无法区分绵羊和山羊，同时使用BspTI和ApoI这2种限制性内切酶消化产物可以区分绵羊肉和山羊肉。在BspTI酶消化物中，在山羊样品中观察到323和133 bp的2个片段，在绵羊样品中未观察到切割，当所有组合中混合物比例为75∶25时，该技术仍可区分动物种属。PCR-RFLP检测是区分密切相关种属（如牛/水牛和绵羊/山羊）的有效方法，该方法具有较高的精密度和专属性，且花费较少。但该方法耗时较长，不适用于现场肉类掺假检测。

2 讨论

近年来，肉类掺假检测技术发展越来越迅速。在试验过程中，研究人员使用多种技术对肉类掺假进行检测，每种技术都有其各自的优缺点。基于DNA的物种鉴定技术逐渐取代其他传统技术，这是因为DNA分子存在于个体的任何组织中，其结构稳定、较耐高温，在不高于121 ℃的情况下稳定性也较强。因此，使用基于DNA的方法提高了检测的特异性及灵敏度。普通PCR方法操作简单，特异性强，可以检测到微量的掺假数量，但检测数量不能精确到具体的拷贝数量，且存在一定的感染可能性；实时荧光定量PCR由于是在闭管中进行检测的，降低了污染的可能性，可检测出肉类掺假物种及数量，但其需要昂贵的仪器，对实验环境要求较严格；环介导等温扩增技术无需昂贵的仪器，仅需一个水浴锅，在40 min左右即可完成检测，耗时短，且对实验环境及仪器没有严格要求，也可通过向反应混合物中加入SYBR Green I染料目视测定LAMP反应，但沉淀物可视化的难度高，尤其是在较低的目标DNA浓度和交叉污染的高风险下，可能限制LAMP检测的有用性，且其引物设计及筛选工作量较大、较繁琐；数字PCR根据质量与DNA拷贝数之间的线性关系，即可精确检测出肉制品的掺假的拷贝数，特异性强，灵敏度高，耗时短，但对实验操作要求较高，操作繁琐；限制性片段长度多态性方法，可同时检测多个物种，其灵敏度高，专属性强，花费少，但其耗时较长。随着技术的发展，建立一种耗时短、花费少、灵敏度高的检测方法是肉类产假行业的必然之事，随着肉制品掺假检测技术的逐步成熟，肉制品掺假必将寸步难行。

3 结语

PCR法在肉类科学领域的应用研究越来越多，因为该技术具有应用迅速而无需进一步样品制备的优点。许多研究表明，分子生物学PCR法是一种强大的分析工具，可以通过确认种属的真实性，在增加消费者对肉类和最终肉制品的信心中发挥作用，特别适用于定性及定量检测。因此，可能在肉类掺假检测中替代基于形态学检测方法、基于代谢物检测方法、基于蛋白质检测方法。但该方法目前主要是用于定性检测，对于定量检测还不普遍。随着科学的飞速发展，相信PCR法与其他方法进行有机的结合使用也是指日可待的，肉类掺假检测方法将会有更大的发展空间。