益生菌干酪乳杆菌Zhang VBNC态和正常态的代谢组学研究

包秋华，王丽娜，张雨虹，彭江英，马学波

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室，呼和浩特 010018）

0 引言

干酪乳杆菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，Lb.casei Zhang）是从内蒙古传统发酵酸马奶中分离筛选的一株具有自主知识产权的益生菌，经研究表明该菌株具有改善肠道菌群、拮抗致病菌、免疫调节、抗氧化、预防治疗肿瘤等益生功能，是我国完成的第一株乳酸菌基因全序列测序的菌株，目前已经发表该菌株的相关研究论文178篇，是研究比较深入的益生菌，目前已经在乳制品、医药以及养殖等领域中被广泛应用[1-5]。乳酸菌在生产和应用过程中，不可避免的要经历低温、低酸、寡营养、光照及辐射强度等不利条件。在这些逆境条件下细胞表面和内部成分均会发生改变，导致细菌活力下降，部分乳酸菌能进入VBNC态(Viable but non-culturable，VBNC)[6-9]。VBNC态的细菌会发生许多新陈代谢的变化，包括营养物质运输的减少、大分子合成的减少以及呼吸速率降低等，进入VBNC状态后的细菌不能在常规培养基上生长分裂，但保留了细胞完整形态，并有呼吸、蛋白质合成、基因转录等低的代谢活性[9-11]。

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白组学之后新兴的一门组学技术，是能通过对生物体代谢产物进行定性定量分析进而揭示生命活动现象和过程的重要技术[12]。液相色谱-质谱联用（LC-MS）是代谢组学常用的分析方法之一，具有高效和高灵敏度等优点，适用于各种复杂样品微量成分的分离和分析[13]。与其它组学相比，代谢组学的优势在于基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物上放大。本实验以Lb.casei Zhang VBNC态和正常态为研究对象，利用超高效液相色谱-质谱仪联用技术对Lb.casei Zhang两种状态下的差异代谢物进行测试和比较分析，从代谢组学层面揭示该菌株进入VBNC态后的代谢特性，为进一步探索Lb.casei Zhang在逆境条件下的生存机理提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验药品与仪器

1.1.1 菌株来源

Lb.casei Zhang是由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种库保藏和提供。

1.1.2 材料与试剂

甲醇、乙腈，CNW科技公司；乙酸铵，Sigma公司；氨水，Fisher Chemical；MRS液体培养基，Oxoid公司；超纯水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.1.3 仪器与设备

1.2 方法

1.2.1 Lb.casei Zhang的诱导和活化

将Lb.casei Zhang接种到液体MRS培养基中，在恒温培养箱中37℃培养18～24 h，按2%的接种量活化至第3代，测得此时的培养基p H为3.8±0.1，趋于稳定。将处于对数期的Lb.casei Zhang三代菌液在4℃条件下进行低温低pH诱导（本文略），得到Lb.casei Zhang VBNC态，将其编号为LCZ 1。将正常活化的Lb.casei Zhang三代菌液编号为LCZ2。

1.2.2 样品的制备与检测

移取两种样品各100μL至2 mL EP管中，分别加入400μL提取液（v甲醇：v乙腈=1∶1），含同位素标记内标混合物），涡旋混匀30 s，超声10 min（冰水浴）,将样品放在-40℃静置1 h后，在4℃条件下，12 000 rpm离心15 min，取上清液于进样瓶中上机检测。

该实验使用Vanquish (Thermo Fisher Scientific)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水，B相为乙腈。样品盘温度：4℃，进样体积：3μL。

Thermo Q Exactive HFX质谱仪能够在控制软件（Xcalibur，Thermo）控制下进行一级、二级质谱数据采集。质谱检测参数如下。

1.2.3 数据处理

初中学生的升学率不仅仅是教师和学校关注的问题，很多家长也认为应试教育是最适合初中学校采用的教学方法。特别是对于地理科目来说，许多家长并不十分重视学生在地理科目方面的发展，认为学生只需要在考试之前将知识点进行背诵和记忆，考试中拿到高分即可，并不需要在地理科目中花费较多的时间，而是应该将精力放在学习语文、数学、英语等主要的科目上。同时，很多家长也并没有正确认识到不同学生之间存在的差异，也并不关心学生是否能够从各个方面进行全面发展，而是只关心学生的考试成绩和学生是否能够考到重点的高中。在这种情况下，教师如果要应用差异教学方法来进行地理科目的教学，就会面临着来自家长以及其他方面的较大的压力。

将原始数据经ProteoWizard软件转成mz XML格式后，使用自主编写的R程序包（内核为XCMS）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。将原始数据经预处理后导入在线分析软件MetaboAnalyst 5.0进行正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal partial least squarediscriminate analysis，OPLS-DA)。依据OPLS-DA模型的变量投影重要性指标（Variable importance in the projection，VIP）≥1、P＜0.05及变化倍数（Folder change，FC）＞2的方法筛选显著差异代谢物。

表1 质谱检测参数

2 结果与分析

2.1 Lb.casei Zhang VBNC态和正常态色谱图分析

本研究利用LC-MS代谢组学技术对干酪乳杆菌Zhang的VBN C态和正常态两种细胞代谢物进行检测分析并在正离子、负离子模式下分别对样品进行了检测，结果显示，在正离子和负离子模式下分别检测到874个和368个代谢物。图1和图2分别显示了Lb.casei Zhang VBNC态和正常态在正离子和负离子模式下的总离子流图。

由图1和图2可知，色谱峰基线平稳，保留时间的重现性较好，表明本研究所使用的方法是稳定可靠的，稳定性和重复性都很好，适用于本试验样品的测定。另外，从图1和图2中还可以看出，Lb.casei Zhang VBNC态和Lb.casei Zhang正常态两种细胞状态代谢物的色谱峰数量、离子强度和色谱峰的保留时间等方面都存在明显的差异。

图1 正离子模式下Lb.casei Zhang VBNC态和正常态总离子流图

图2 负离子模式下Lb.casei Zhang VBNC态和正常态总离子流图

2.2 Lb.casei Zhang VBNC态和正常态OPLS-DA图分析

为了获得两组之间主要差异的相关代谢物信息，本研究利用多元变量统计分析软件Simca 14.1对两种细胞状态下Lb.casei Zhang的代谢组进行了有监督的正交偏最小二乘法-判别分析(Orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA)。正离子模式和负离子模式下的OPLS-DA结果见图3。

图3 Lb.casei Zhang VBNC态和正常态OPLS-DA图分析

从图3两组OPLS-DA图中可以看出，在正离子和负离子两种模式下，Lb.casei Zhang VBNC态（LCZ1）和正常态（LCZ2）两组间分离效果较好。在正离子模式下R2Y为1，Q2为0.984；在负离子模式下，R2Y为1，Q2为0.991。在多元统计分析建模时，R2Y表示Y轴方向模型的累积解释率，可以理解为Y轴方向保留原始数据信息百分比的平方，Q2代表模型的累积预测率，R2Y和Q2这两个值＞0.5为好，越是接近1表明该模型越理想，对样本具有较好的解释率和预测率[14]。本试验中R2Y和Q2均接近1，说明本实验模型的区分程度和预测程度都较好。

为了防止检测结果为假阳性，进一步对两组数据进行置换检验（Permutation test）分析。置换检验随机置换了200次。分离模型用原始的数据来证明所有置换值都是合适的，正、负离子模式下的置换检验图见图4所示。

图4 Lb.casei Zhang VBNC态和正常态的置换检验图分析

从图4两组置换检验图中可以看出，原始值与置换值以及R2和Q2之间的关系，并用回归直线表示，其截距是衡量过度拟合的指标，该实验两个模型的Q2的斜率值大于R2的斜率，证明了数据不存在假阳性，说明模型稳健，结果可信度高。

2.3 Lb.casei Zhang VBNC态和正常态细胞的差异代谢物的筛选

对数据预处理后得到的正离子和负离子模式下的874个和368个代谢物，应用MetaboAnalyst 5.0在线分析软件进行对Lb.casei Zhang VBNC态和正常态的细胞代谢物进行标准化处理与分析。随后根据OPLS-DA模型的变量投影重要性指标（Variable importance in the projection，VIP）≥1并结合P＜0.05及变化倍数（Folder change，FC）＞2的筛选原则，并通过数据库比对鉴定得到了24个主要差异代谢物，具体差异代谢物见表2。

表2 Lb.casei Zhang VBNC态和正常态细胞的主要差异代谢物

从表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC态和正常态两种细胞状态下筛选出的24个主要差异代谢物分为氨基酸类、糖类、维生素类、脂肪酸类、短肽类和嘌呤类共6类，这些相关代谢物的变化代表了干酪乳杆菌Zhang在由正常态进入VBNC态过程中的生理化学变化。

2.4 主要差异代谢物的分类分析

2.4.1 氨基酸类

从表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC态与正常态细胞的代谢物相比，主要氨基酸差异代谢物有8种，其中Lb.casei Zhang VBNC态中色氨酸、牛磺酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、赖氨酸和蛋氨酸6种氨基酸均低于正常态细胞，说明Lb.casei Zhang正常态细胞在诱导进入VBNC态过程中为了满足生长和存活需要不断消耗氨基酸，导致代谢物差异物显著性减少。另外，Lb.casei Zhang VBNC态中L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺二种氨基酸含量高于正常态细胞。L-天冬酰胺由天冬氨酰合成酶消耗ATP并转化成L-天冬氨酸产生的[15]。L-谷氨酰胺主要通过谷氨酰合成酶和谷氨酸脱氢酶转化而成。在逆境胁迫的条件下，氨基酸大量积累可以起到细胞保护的作用[16]，因此推测Lb.casei Zhang VBNC态中L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺增多在一定程度上可能对逆境条件下干酪乳杆菌Zhang起着保护作用。

2.4.2 糖类

从表2可以看，Lb.casei Zhang VBNC态与正常态两种状态下的主要糖类差异代谢物有4种，其中VBNC态细胞的海藻糖显著性高于正常态细胞。海藻糖是生物体对于外部环境变化所形成的一种典型的应激代谢物，保护机体抵抗外部恶劣环境，且有些微生物对外界恶劣环境，如干旱、高温、寒冷、高渗透等，所表现出来的抗逆性和它们体内存在有海藻糖密切相关[17]。本研究的Lb.casei Zhang在低温低pH下能存活的VBNC态细胞内海藻糖升高的结果与上述观点一致。海藻糖对细胞的保护作用是海藻糖中的羟基代替水分子，通过氢键与生物体内的蛋白质、糖类、脂类等大分子物质结合，从而稳定并保持大分子的结构和功能[18]。此外，也有研究表明，海藻糖的保护作用还可能源于其四面体氢键合水的重构作用，这种作用能够使水分子之间氢键的强度得到加强[19]，从而达到保护细胞的作用。由此推测Lb.casei Zhang在低温低pH下海藻糖的变化也有类似作用。此外，Lb.casei Zhang VBNC态与正常态细胞相比，葡萄糖、D-木酮糖和古洛塘等3种代谢物低于正常态，说明Lb.casei Zhang正常态细胞在低温低pH逆境条件下进入VBNC态过程中消耗了这3种糖类物质，导致代谢差异物显著性减少。

2.4.3 维生素

从表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC态与正常态细胞相比，主要维生素类差异代谢物有3种，其中吡哆醛和生物素显著性下降，脱硫生物素显著性上升。维生素是参与生物生长发育和代谢所必需的一类微量有机物质，在物质的代谢中有重要作用，例如，吡哆醛，核黄素与尼克酰胺等是乳酸菌的重要生长因子[20]。脱硫生物素是合成生物素所必须的前体物质，转化过程中硫原子由生物素合成酶的Fe-S簇提供[21]。有研究表明当维生素含量低于最佳状态会抑制乳酸菌生长，这是由于培养过程中微生物代谢以及冷藏过程中维生素的化学分解所造成的[22]。因此，这很好的解释了干酪乳杆菌Zhang在低温低pH诱导后进入VBNC态过程中吡哆醛和生物素含量下降的主要原因。

2.4.4 脂肪酸

从表2可以看出，Lb.casei Zhang VBNC态与正常态细胞相比，主要脂肪酸差异代谢物有3种，棕榈油酸（C16∶1）、16-羟基棕榈酸和十六碳-7-烯酸3种物质均显著性上升。梅迩蓝[23]等人报道了Lb.casei Zhang在人工胃液的低酸胁迫下，细胞膜脂肪酸组成发生了变化，不饱脂肪酸的相对百分含量高于饱和脂肪酸，推测该菌在低pH下通过改变膜脂肪酸的组分和含量来减少逆境对细胞的损伤。本实验中棕榈油酸（C16∶1）和十六碳-7-烯酸均为不饱和脂肪酸，其升高的原因可能也是Lb.casei Zhang在低温低酸VBNC诱导过程中的细胞膜脂肪酸的组成和含量发生了变化的应激反应。吴重德[24]等也证明了干酪乳杆菌Zhang适应性进化菌株（pH 4.3 MRS培养基中连续传代70 d）在酸胁迫条件下，细胞膜脂肪酸种类及含量会发生了变化，不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸比率（UFA/SFA，不饱和度）增加，同时还通过增加脂肪酸链长度等，来减少由逆境胁迫引起的对细胞造成的伤害，提升耐酸性。以上关于干酪乳杆菌Zhang在不同酸胁迫下脂肪酸变化的结论也很好地论证了本实验干酪乳杆菌Zhang VBNC中不饱和脂肪酸增加的原因。

2.4.5 短肽和嘌呤类

从表2可以看，Lb.casei Zhang VBNC态与正常态细胞相比，甘氨酰-L-酪氨酸、甘氨酰-L-缬氨酸和L-丙氨酰-L-亮氨酸等3种短肽代谢物是增加的。短肽具有一定的生理活性，包括抗氧化、降血糖等作用[25]。另外，本研究中Lb.casei Zhang VBNC态与正常态相比，鸟嘌呤和黄嘌呤呈显著性增加的趋势。嘌呤是细胞中最丰富的代谢物种，对于提供细胞能量及细胞内信号传导起着十分重要的作用。干酪乳杆菌可以分解嘌呤和嘧啶作为生长的碳源、氮源和能源，在分解腺嘌呤过程中，腺嘌呤被腺嘌呤脱氨酶分解为次黄嘌呤，进一步被分解为黄嘌呤，为Lb.casei Zhang VBNC态的生长代谢提供了一定的条件。

3 结论

本研究采用LC-MS技术对Lb.casei Zhang正常态和VBNC态的代谢组进行比较分析。通过多元变量统计分析结合单变量统计分析，共筛选并鉴定得到包括海藻糖、吡哆醛、脱硫生物素等在内的24种主要差异代谢物，其中Lb.casei Zhang VBNC态与正常态相比，有L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、棕榈油酸和鸟嘌呤等12种代谢物呈显著性上升的趋势，有赖氨酸、葡萄糖、生物素等12种主要差异代谢物呈下降的趋势（P＜0.05），这些差异代谢物的变化不仅为Lb.casei Zhang VBNC态的生存代谢提供一定的条件，也为探索Lb.casei Zhang VBNC态在逆境条件下的存活机理提供了一定的参考。