具有吸附重金属铅能力乳酸菌的安全性评价

张亮，于哲，张慧敏，贺银凤

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018)

0 引言

重金属铅污染与人类活动有密切的关系[1]。环境中的铅自发降解缓慢[2]，通过植物与动物间接进入人体[3]。进入人体的铅易蓄积且不易排出，长期对人体生殖系统、神经系统等产生损伤[4]。考虑到铅对环境和人体的危害，需要采取措施将环境和人体中的铅移除[5]。过去常采用物理化学法去除铅，因其效率低下、价格高昂、操作繁琐逐渐被微生物修复法所替代[6]。近些年的研究发现，乳酸菌胞壁的成分在其吸附重金属方面有着关键的作用[7]。因此，深入发掘具有吸附铅能力且安全的乳酸菌，并利用其去除食品、水、动物饲料中的重金属，一直是国内外研究的热点[8]。

乳酸菌多分布于人与动物肠道中，它们可以调节人与动物肠道的菌群结构和生理功能，同时，一部分乳酸菌还有治疗腹泻、增强免疫力、降血压、治疗抑郁、抗肿瘤等保健和医疗作用[9]。乳酸菌有悠久的使用历史一向被认为是安全的，但一些研究结果表明，乳酸菌可能侵染宿主，使宿主产生不良的反应，严重者甚至危及生命，例如乳酸杆菌存在宿主免疫低下时使其患病的风险[10]。部分乳酸菌拥有硝基还原酶或氨基酸脱羧酶，使其代谢活动产生具有致癌作用生物胺和亚硝基类化合物[11]。随着传统发酵食品中乳酸菌负面报道日益增加，采用单一抗生素治愈变得愈发困难，发酵食品中微生物的耐药性越来越引起人们的重视[12]。出于人道主义角度，试验菌株在进行体外安全性评价确认在外部环境下是安全可靠后，方可进行体内评价程序。本文通过体外与体内结合的方法，较系统的对实验室前期分离的乳酸菌进行安全性评价，为生产安全健康的具有吸附重金属铅能力的菌粉产品奠定基础为实际生产应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

健康昆明小鼠，内蒙古大学实验动物研究中心，清洁级，体重(20±2)g。

1.1.2 菌株

戊糖片球菌10-a-1、9-b-1、F-e-3、F-f-3与海氏肠球菌Qaa，分离自内蒙古自治区包头市白云矿区；大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923，植物乳杆菌CICC6238、甲型溶血链球菌BNCC102663，内蒙古农业大学食品生物技术团队保存。

1.1.3 仪器与材料

吲哚脱羧酶肉汤培养基、硝酸盐还原酶肉汤培养基、氨基酸脱羧酶肉汤培养基、兔血琼脂平板，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；细菌提基因组试剂盒、小型质粒提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL20000 DNA Marker、6×Loading buffer、Gel View核酸染料，北京博迈德科技发展有限公司；D/L-乳酸检测试剂盒，爱尔兰Megazyme公司；粘蛋白，Sigma-Aldich；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；2 mL一次性真空采血管，石家庄康卫仕医疗器械有限公司；谷草转氨酶测定试剂盒、谷丙转氨酶测定试剂盒、γ-谷氨酰转肽酶测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌对铅吸附能力测定

菌株对铅吸附能力测定参照文献[13]方法，将实验室前期筛选的5株乳酸菌活化三代后，离心(4 000 r/min,10 min)获得菌体，经超纯水洗涤3次后，制成50 g/L（湿重）的菌悬液。在48孔方形深孔板中加入1.4 mL的铅离子水溶液(50 mg/L,pH6.5)，加入菌悬液，使铅离子水溶液中的菌体终浓度达到5 g/L。利用深孔摇床培养器振荡(37℃,800 r/min)60 min，取吸附液离心(14 000 r/min,5 min)获得上清液，使用火焰原子吸收分光光度计测定其中铅离子含量。进行2次平行3次重复试验。取50 mg/L的铅标准溶液配制成浓度为0、10、20、30、40、50 mg/L的标准溶液，利用火焰原子吸收分光光度计测定其对应吸光度值，以标准曲线工作液的浓度为横坐标，对应吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线并求出吸光度值与浓度关系的一元线性回归方程。于测定标准曲线工作液相同条件下，测定吸附后上清液的吸光度值。代入标准系列的一元线性回归方程中求样品中铅离子的含量，平行测定3次。铅的吸附率和单位质量菌体对铅的吸附量的计算方法分别如下所示：

其中M0代表初始溶液中铅离子的含量(mg)；M1代表吸附后溶液中铅离子的含量(mg)；m代表添加的乳酸菌菌体量(g)。

1.2.2 生长曲线测定

菌株生长曲线测定参考文献[14]方法，稍作修改，将活化好的菌液按照2%接种量至MRS液体培养基中每过2 h使用紫外分光光度计测595 nm处吸光值，同时梯度稀释后涂布在MRS固体培养基上。持续48 h后，绘制OD595与活菌数对数值生长曲线。

1.2.3 菌株的安全性评价

（1）有害代谢产物试验。将活化至2代的乳酸菌与质控菌株用生理盐水洗涤3遍后，调OD595值至1，再按照2%接种量分别接种到含有赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸的肉汤培养基中，37℃，培养3 d，滴加指示剂呈现黄色为阴性，紫色为阳性。

(2)吲哚试验。将活化至2代的乳酸菌与质控菌株用生理盐水洗涤3遍后，调OD595值至1，再按照2%接种量接种至吲哚肉汤培养基中，37℃，培养3 d，先滴入5～10滴乙醚，再缓慢滴入靛基质试剂，阴性乙醚层不变色，阳性乙醚层变为暗红色。

(3)硝酸盐还原酶。将活化至2代的乳酸菌与质控菌株用生理盐水洗涤3遍后，调OD595值至1，再按照2%接种量接种至硝酸盐肉汤中，37℃，培养5 d，先加入硝酸盐还原试剂甲液再加入乙液，阴性为淡粉色，阳性为暗红色。

(4)D-乳酸检测。将活化至2代的乳酸菌用生理盐水洗涤3遍后，调OD595值至1，再按照2%接种量接种至脱脂乳培养基中，37℃，培养7 d后称取1 g脱脂乳，按照D/L-乳酸检测试剂盒进行操作。

(5)溶血试验。溶血试验参考文献[15]中报道的方法，稍作修改，将活化至2代的乳酸菌与质控菌株甲型溶血链球菌为α-溶血、金黄色葡萄球菌为β-溶血、植物乳杆菌为γ-溶血，用生理盐水洗涤3遍后，调OD595值至1，再用接种环至5%兔血血琼脂平板，37℃，培养2 d观察结果。

(6)乳酸菌药物敏感试验。药物敏感试验参考美国临床和实验室标准协会中对细菌进行的方法[16]。选取常见的8种药敏纸片，包括链霉素、诺氟沙星、万古霉素、四环素、庆大霉素、青霉素G、阿莫西林和红霉素，采用药敏纸片扩散法进行细菌药物敏感试验。以大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控标准菌。取100μL菌液分别涂布于MRS固体培养基平板上，待菌液被培养基完全吸收后，将药敏纸片按照合适的位置贴入平板内，静置5 min后，37℃，培养24 h后，测量并记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小。

(7)质粒检测。乳酸菌质粒检测参考文献[17]中报道的方法，将活化至2代的乳酸菌与质控菌株，取3 mL，使用博迈德质粒小提试剂盒提取质粒。提取步骤参照说明书。提取样品用琼脂糖凝胶电泳检测，以含有质粒的大肠杆菌ATCC25922为对照。

1.2.4 急性毒性试验

将适应环境的健康昆明小鼠，分为2组，每组10只，雌雄各半，分别是对照组，戊糖片球菌10-a-1组。对照组用0.85%的生理盐水灌胃，试验组采用1.2.5.1灌胃菌液的制备方法制得菌液经口灌胃。灌胃前1天小鼠禁食16 h，自由饮水，灌胃后1、3、5、7 d记录小鼠体重变化，每天采食量，一般表现、行为及中毒表现。一般表现、行为及中毒表现主要包括行为、动作、各种刺激反应、瞳孔大小、鼻孔、呼吸、粪便硬度颜色、皮毛、眼球、姿势等。

（1）灌胃菌液的制备。本实验按照GB 15193.3-2014[18]的规定中的上-下法执行，灌胃剂量采用默认计量梯度系数为3.2，高剂量组为2 mg/（g·BW）。取戊糖片球菌10-a-1在37℃培养箱培养至第二代，将培养至稳定期的菌液8 000 r/min 4℃离心5 min，弃上清液，留下菌泥再用0.85%浓度的生理盐水洗涤2遍。将戊糖片球菌10-a-1菌泥真空冻干测菌泥水分含量70%左右，所得湿菌泥的高剂量为6.667 mg/（g·BW）。灌胃溶剂采用0.02 mL/（g·BW）小鼠体重的0.85%生理盐水，将湿菌泥溶于0.85%生理盐水中。

（2）小鼠生产性能、脏器指数试验。小鼠生产性能是将小鼠适应环境后正式开始试验时第1 d的初始体重以及第7 d体重记录，并每日记录小鼠的摄食量。脏器指数将小鼠脱颈处死后，取心、肝、脾和肾用0.85%生理盐水涮洗血渍，放到擦镜纸上吸干水分，进行称重并记录。

（3）小鼠血液生化指标。将急性毒性试验小鼠乙醚麻醉后摘眼球取全血于EDTA抗凝管中，3 500 r/min、10 min，检测血清中的酶采用测定试剂盒，包括谷草转氨酶、谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶。

（4）肠黏膜组织学检查。将急性毒性试验中对照组与试验组的小鼠回肠，盲肠，结肠取2 cm，用生理盐水将肠道内容物清理后，放入4%多聚甲醛固定液中，送往爱博试剂公司进行切片，采用苏木精-伊红染色用光学显微镜上的目镜测微计测量形态学参数。记录上皮细胞高度、绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度;每个样本的每个参数随机进行10次测量，并将这些测量值的平均值用于统计分析。

1.3 数据分析

试验组内组间重复3次，采用SPSS23.0和One-Way（ANOVA）进行统计和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 吸附重金属铅乳酸菌基础测定

2.1.1 乳酸菌对铅吸附能力的测定

将课题组前期从包头白云矿区和包钢矿区分离筛选的5株益生特性好的乳酸菌，在其最适生长环境下进行重金属铅吸附试验，10-a-1、F-e-3、F-f-3、9-b-1与Qaa对铅的吸附率分别为87.73%±1.18%、83.67%±2.14%、85.77%±1.85%、90.10%±0.85%、70.95%±3.18%。与李畅研究的乳酸菌吸附效果基本一致[19]。

2.1.2 生长曲线测定

在进行有害代谢产物试验时，常使用比浊法进行供试菌液制备，由于测定的是浊度，把活菌与死菌都估算在内，无法准确估量衰退期，而平板菌落计数法能够真实准确的反映活菌数的动态变化增加实验准确度。在这里选用了活菌数与OD595值结合制作生长曲线。选择37℃，pH 6.5测定5株乳酸菌生长曲线，其生长状况如图1所示，在0～2 h，F-f-3处于延滞期，在2～8 h，Qaa、F-f-3和10-a-1处在对数生长期，在2～10 h时9-b-1和F-e-3处在对数生长期，随后5株菌都进入稳定期，在24 h后开始进入衰亡期。在各株菌活菌数到达1.5×108时OD595值大约为1。

图1 乳酸菌的生长曲线

2.2 菌株的安全性评价

2.2.1 有害代谢产物试验

乳酸菌酶种类多且活力高，参与宿主的多种生命活动，但在此过程中一部乳酸菌能产生吲哚、亚硝酸盐、有害胺类化合物和D-乳酸等代谢废物会对宿主健康产生威胁，从而引起了广泛的关注。

色氨酸作为人体的必需氨基酸，在人体发挥着重要作用，如调节免疫、促进消化和改善睡眠等。如果代谢发生障碍会引起肠道炎症、统合失调和癌症等[20]。5株乳酸菌经试验，其代谢产物无吲哚类物质。

硝基还原酶是一类依赖于黄素单核苷酸或黄素腺嘌呤二核苷酸的细胞质酶，可利用NAD(P)H实现硝基芳香族化合物和硝基杂环衍生物的还原代谢。硝基还原酶能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐摄入过量会导致头晕头痛，严重时可能导致生命危险。并且已经有乳杆菌和双歧杆菌具有硝基还原酶活性的报道。5株乳酸菌经试验，没有发现硝基还原酶的存在。

氨基酸脱羧酶能将精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸代谢成为有害的鲱精胺、尸胺和腐胺，对人的神经系统、免疫系统等产生不利的影响，从而引起了广泛的关注。本研究将5株乳酸菌进行了氨基酸脱羧酶活性检测。结果显示，10-a-1、F-f-3与9-b-1无脱羧能力，Qaa与F-e-3有将精氨酸脱酸还原为鲱精胺能力。许女等人对老陈醋中筛选的20株乳酸菌进行了氨基酸脱羧酶活性检测试验，发现5株菌具有将鸟氨酸脱羧还原成腐胺的能力[21]。

乳酸根据旋光性的不同，分为L-乳酸和D-乳酸两种。由于人体内只有代谢L-乳酸的酶，若摄人过量的D-乳酸，则会引起代谢紊乱甚至酸中毒。正常机体对少量的D-乳酸不会产生明显的不适感，但对短肠综合征人群和通过手术减肥的人群则会引起D-乳酸血症、昏迷及肠道不适，随着减肥手术的普及这种代谢紊乱疾病可能会更加常见[22]。本研究将5株乳酸菌进行了D-乳酸检测，发现Qaa、F-e-3、F-f-3会产生微量的D-乳酸。

2.2.2 溶血试验

溶血活性试验是探究细菌致病机理常采用的研究方法，根据Ji等人的研究表明，溶血活性试验是通过将纯化后的培养物划线在添加5%脱蛋白羊血的琼脂培养基上进行的[23]。试验采用甲型溶血链球菌为α-溶血质控，金黄色葡萄球菌为β-溶血质控，植物乳酸菌为γ-溶血质控。对比5株试验菌株，9-b-1有β-溶血能力，其余4株为γ溶血。Arellano Karina等人对15株植物乳杆菌进行溶血试验后结果表明其中从昆虫、绿茶、泡菜分离的共5株产生了α-溶血[24]。

图2 溶血试验结果

表1 有害代谢产物实验结果

2.2.3 药物敏感试验与耐药基因转移风险

随着抗生素的研发和滥用，多重抗药的细菌和致病菌大量出现，给医疗体系增加了救治难度，对人体健康带来了巨大的隐患。乳酸菌一直是公认的对人类安全的细菌。乳酸菌中出现抗药性本身没有危险，而且是有利的，因为它能增加乳酸菌抵抗环境胁迫的能力，增强其对环境的适应性。近年来，大量深入的研究表明，许多乳酸菌抗性基因能在乳酸菌之间甚至是在乳酸菌与病原菌之间进行传播。同时一些研究还指出了抗性基因是由质粒或转座子介导的，则水平基因转移的风险比内在抗性基因在染色体上编码时高[25]。因此，对乳酸菌抗药性及抗药基因的转移性的研究是很有必要的。本试验对5株乳酸菌和2株质控菌株进行了8种抗生素的药物敏感试验，在质控合格是得出结果，5株乳酸菌对红霉素都是中度敏感，对其余7种抗生素都显示耐药。同时，在检测有无耐药基因转移风险时，显示5株乳酸菌均不含有耐药质粒，即不携带有可转移到耐药基因。

表2 耐药性实验检测结果

图3 质粒提取电泳

2.3 急性毒性试验

在毒理学试验中，受试动物的进食量、体重变化以及脏器与体重的比值通过与生理盐水组的比较，可以反映出受试物对动物机体的影响，可以作为评价受试物毒性的重要指标。本试验对昆明小鼠采用质量浓度为6.667 mg/（g·BW）的戊糖片球菌10-a-1菌泥进行经口灌胃，阴性对照组采用0.85%生理盐水灌胃。1、3、5、7 d一般行为观察显示试验组小鼠行为正常、皮毛光泽、粪便等均正常，与阴性对照组的小鼠一般行为无差异。

2.3.1 小鼠生产性能试验

由表3可以看出，在小鼠生产性能试验中，雌雄小鼠在适应环境后的称重，体重无统计学差异(P＞0.05)，当采用最大灌胃剂量经口灌胃后，第7 d称重时因为性别差异，雌雄小鼠的末重与平均采食量有统计学差异(P＜0.05)，但进行同性别的试验组与对照组比较时，雌雄小鼠在末重与平均日采食量上是无统计学差异(P＞0.05)，表明戊糖片球菌10-a-1，对小鼠无毒。

表3 小鼠生产性能试验(x±sd，n=5)

2.3.2 小鼠脏器指数分析

由表4可以看出，在急性毒性试验中同性小鼠试验组与对照组的心、肝、脾和肾是无统计学差异的(P＞0.05)，雌性小鼠的肾体比有统计学差异(P＜0.05)是因为性别导致，由小鼠脏器指数分析表明戊糖片球菌10-a-1，对小鼠无毒。

表4 小鼠脏器指数分析表(±sd,n=5)

表4 小鼠脏器指数分析表(±sd,n=5)

注：同行数据字母相同表示无统计学差异（P＞0.05），不同字母表示有统计学差异（P＜0.05）。

雄性 雌性试验组 对照组 试验组 对照组心体比 0.0066±0.0006a 0.0060±0.0005a 0.0056±0.0007a 0.0061±0.0011a肾体比 0.0166±0.0022a 0.0161±0.0010a 0.0131±0.0029b 0.0132±0.0011b脾体比 0.0059±0.0052a 0.0052±0.0044a 0.0056±0.0023a 0.0054±0.0004a肝体比 0.0493±0.0073a 0.0518±0.0047a 0.0497±0.0147a 0.0503±0.0078a项目

2.3.3 小鼠血液生化指标

由表5可以看出，雌雄小鼠试验组与对照组血液生化指标中谷丙转氨酶和谷草转氨酶无统计学差异(P＞0.05)，因为谷丙转氨酶与谷丙转氨酶是反应肝脏受损程度的两个指标，说明单次高剂量灌入戊糖片球菌菌液对小鼠无毒害作用。同时反应肝脏受损程度的辅助指标γ-谷氨酰转移酶显示试验组与对照组无统计学差异(P＞0.05)，更进一步说明，受试物对小鼠肝脏无毒副作用。

表5 小鼠血清生化指标分析表(±sd,n=5)

表5 小鼠血清生化指标分析表(±sd,n=5)

注：同行数据字母相同表示无统计学差异（P＞0.05），不同字母表示有统计学差异（P＜0.05）。

雄性 雌性试验组 对照组 试验组 对照组谷丙转氨酶ALT/（U·L-1）项目20.87±4.55a 18.55±3.95a 19.34±4.07a 19.83±4.08a谷草转氨酶AST/（U·L-1）43.35±5.66a 41.79±4.11a 40.68±6.68a 37.12±5.08a γ-谷氨酰转移酶/（U·L-1）37.76±3.3a 33.67±4.65a 34.04±3.49a 35.24±3.7a

2.3.4 肠黏膜组织学检查

由表5可以看出，在回肠的黏膜高度、厚度和上皮细胞高度中，试验组与对照组无统计学差异(P＞0.05)，在盲肠的黏膜厚度和上皮细胞高度中，试验组与对照组无统计学差异(P＞0.05)，在结肠的黏膜厚度和上皮细胞高度中，试验组与对照组无统计学差异(P＞0.05)，证明戊糖片球菌10-a-1不会对小鼠肠道产生炎症和分解黏蛋白能毒副作用，可以看出其对小鼠肠道是安全的。

表6 乳酸菌对肠道形态的影响(x±sd,n=5)

3 结论

将5株乳酸菌前期进行吸附铅能力测定与生长曲线测定，为后续安全性评价做铺垫。在乳酸菌生长繁殖过程中，菌株会产生多种酶来辅助其生命活动，但例如色氨酸分解酶、硝酸盐还原酶、氨基酸脱羧酶等会使其产生的有害代谢物，如果超过一定阈值，将对人体有害[26]。还有一些具有溶血能力酶的存在使血细胞破裂进而导致人体发生溶血现象[27]。由5株乳酸菌进行安全性评价程序可知，在有害代谢产物试验中，Qaa与F-e-3有将精氨酸脱酸还原为鲱精胺能力，发现Qaa、F-e-3、F-f-3会产生微量的D-乳酸。在溶血活性试验中，9-b-1有β-溶血能力。随着抗生素被人类大量使用，导致世界范围内耐药细菌的出现，为感染性疾病的治疗带来了巨大的难题，细菌抗药性研究引起了世界范围内学者的关注，同时有些乳酸菌携带有可转移的耐药基因的遗传物质，乳酸菌自身携带耐药性没有危险,但是有些有转移耐药基因转移风险的乳酸菌可能会成为致病原[28]。5株乳酸菌在对常见抗生素药物敏感试验中，对红霉素都是中度敏感，对其余7种抗生素都显示耐药，并且无质粒，显示出5株乳酸菌有较好的抵抗环境胁迫能力，同时无耐药基因转移风险。急性毒性试验是毒理学试验最基础也是最重要的一阶段，该试验方法不仅可以直接观察到受试物对生物体的伤害程度，还能为后续试验剂量提供参考价值[29]。通过体外安全性评价试验筛选出的安全性最高的戊糖片球菌10-a-1在急性毒性试验中，从小鼠生产性能、脏体比、血清生化指标与肠道形态看，进一步说明菌株是无毒副作用的。因乳酸菌具有的菌株特异性，对他们进行安全性评价十分必要，也为实际生产应用提供了好的理论基础。