地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶对切达干酪质地特性的影响

张忠明，曹瑛瑛，王 莹，乔海军，张卫兵,*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070）

干酪是一种高蛋白、易于人体吸收的发酵乳制品，含有人体所需的所有必需氨基酸[1]，风味独特、营养丰富。干酪的风味和质地不仅是影响消费者接受程度的重要因素，同时对于制造商、包装商、销售商也很重要。切达干酪成熟时产生的一系列协同的微生物、物理和化学变化有助于形成其特有的质地、风味和微观结构的变化[2-3]。在成熟期间，干酪中残留的凝乳酶、纤溶酶及发酵剂释放的蛋白酶会部分水解酪蛋白基质，对干酪质地和风味的形成有重要影响[4-6]。其中，残留凝乳酶对酪蛋白的水解会增加干酪的流动性，降低干酪的拉伸性能[7]，从而使干酪的质地品质发生变化。因此，研究切达干酪成熟过程中质地特性的变化对于评价干酪的品质具有重要意义。

实验室前期从天祝高寒草原放牧牦牛生活环境的土壤样品中筛选分离得到一株产凝乳酶细菌地衣芽孢杆菌D3.11，研究表明，该菌株所产的凝乳酶酶活力可达89.56 SU/mL，蛋白水解力为21.27 U/mL[8]。宋曦等[9]研究表明，pH值为5～8时地衣芽孢杆菌D3.11凝乳活性随乳pH值的降低而增高，pH 5.5时凝乳活力最高。李贻珍等[10]研究发现，凝乳温度为40 ℃时，地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶凝乳效果较好。本研究分析利用地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶制作的切达干酪成熟过程中质构、流变、微观结构及风味的变化规律，评价地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶在切达干酪中的应用潜力，并为地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶在切达干酪生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜荷斯坦牛乳购自甘肃农业大学奶牛场。

地衣芽孢杆菌D3.11 中国典型培养物保藏中心（保藏编号CGMCC No：3289）；商品凝乳酶（小牛皱胃酶和牛胃蛋白酶质量比为7∶3，酶活力890 IMCU/g）北京多爱特生物科技有限公司；R-704嗜温发酵剂（乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种） 科汉森有限公司；麸皮 淮南鸿汶农业发展有限公司；戊二醛上海中秦化学试剂有限公司；无水乙醇、无水硫酸钠国药集团化学试剂有限公司；氯仿、叔丁醇 天津凯信化学工业有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TX.XT Express质构仪 英国Stable Micro System公司；JSM-6701F低真空扫描电子显微镜 日本电子光学公司；Discovery HR-1混合流变仪 美国TA Instruments公司。

1.3 方法

1.3.1 切达干酪制作

1.3.1.1 切达干酪加工工艺流程

切达干酪加工流程：原料乳→63 ℃巴氏杀菌30 min→冷却至35 ℃→添加发酵剂（0.006 25 g/L）→添加CaCl2（0.3 g/L）→添加凝乳酶（200 SU/mL）→凝乳→切割、排乳清→加盐、搅拌→二次加热→排乳清→堆酿→压榨成型→真空包装→成熟6 个月

按照上述工艺流程，分别制作3 组切达干酪：1）添加地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶所制切达干酪（CDF组）；2）添加地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶但未添加发酵剂制成的干酪类似物（CD3组）；3）添加商品凝乳酶所制作的切达干酪（CCF组）。

1.3.1.2 切达干酪出品率测定

参照邹鲤岭等[11]的方法。对压榨成型后的新鲜切达干酪进行称质量，按式（1）计算实测出品率。

为了更准确测定切达干酪的出品率，将水分含量校正到40%后按式（2）计算校正出品率。

1.3.2 切达干酪质地分析

1.3.2.1 质构测定

参考刘贺等[12]的方法，稍作修改。将干酪样品切割为规则正方体（2 cm×2 cm×2 cm）。质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）测定参数：触发力5 g，探头类型P36，测试前探头下降速率1 mm/s，测试速率5 mm/s，返程速率5 mm/s；压缩比35%；压缩间隔10 s，每组样品测定3 次。

1.3.2.2 微观结构观察

参考刘兴龙等[13]方法，将干酪样品用刀片切割成纤薄小片，浸入pH 6.8、体积分数2.5%戊二醛中，在4 ℃条件下固定24 h。将固定好的样品用pH 6.8磷酸缓冲液冲洗3 次，每次10 min。将冲洗好的样品分别用体积分数30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇进行梯度脱水，每次10 min，样品脱水后于氯仿中放置2 h进行脱脂，并间隔摇晃。然后分别用无水乙醇、无水乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）、叔丁醇再次脱水，每次6 min。干酪样品冷冻干燥后，采用离子溅射法喷金后置于扫描电子显微镜下进行观察。

1.3.2.3 流变特性测定

参考Lucey[14]的方法，采用温度斜坡测定干酪样品的流变特性。从干酪样品中心取样，样品直径20 mm、厚度2 mm，室温平衡30 min后进行测定。流变仪参数如下：升温速率3 ℃/min，升温范围20～80 ℃，应变0.2%，角频率1 Hz。在测定过程中，记录储能模量（G’）、损耗模量（G’’）和损耗角正切值（tanδ）的变化。

1.4 数据处理

每组实验重复测定3 次，实验数据采用Excel 2016软件进行处理并用SPSS 19.0软件进行显著性分析，采用Duncan’s法进行数据间多重显著性分析，利用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 切达干酪出品率

由图1可知，3 组干酪形态相似，并无明显差异，干酪表面光滑有光泽。为了得到更加准确的切达干酪出品率，在测得实际出品率后，将水分含量校正到40%后得到校正出品率进行比较。

由表1可知，3 组干酪出品率之间均有显著差异（P＜0.05），其中CCF组实测出品率和校正出品率均为最高，其实测出品率和校正出品率均比CDF组高11.95%，比CD3组高6.21%，这与其较高的水分含量有关。

表 1 3 组切达干酪出品率Table 1 Yields rate of three Cheddar cheese

2.2 切达干酪成熟过程中硬度的变化

样品的硬度表示达到给定变形所需的力的大小[15]。由图2可知，成熟时间对干酪硬度有显著影响（P＜0.05），3 组干酪的硬度随着成熟时间的延长均逐渐增大，其中CDF组成熟0～3 个月内硬度增加较为缓慢，成熟4～6 个月内硬度增加较快，整个成熟期内硬度增加1 458.14 g。CD3组成熟2～6 个月内硬度增加较快，在成熟期内硬度增加2 692.87 g。CCF组硬度成熟0～3 个月时增加较为缓慢，在4～6 个月内硬度快速增加，在成熟期内增加3 072.43 g。3 组干酪硬度之间存在差异，CDF组干酪硬度最小。

2.3 切达干酪成熟过程中弹性的变化

弹性是在第1个压缩力被移除后干酪形态的恢复程度[15]。由图3可知，随着干酪的成熟，3 组干酪的弹性均呈现出逐渐降低的趋势。成熟0 个月时，CD3组和CCF组干酪弹性无显著性差异，但显著高于CDF组干酪（P＜0.05）。CCF组干酪在成熟前4 个月表现出较高的弹性，但在5～6 个月时弹性低于CD3组干酪，而CDF组干酪弹性在整个成熟期内始终显著低于CCF组和CD3组干酪（P＜0.05）。

2.4 切达干酪成熟过程中咀嚼性的变化

咀嚼性是在吞咽干酪之前将其咀嚼成均匀状态所需的能量[16]。由图4可知，凝乳酶对干酪成熟过程中咀嚼性的影响显著。随着干酪成熟时间的延长，3 组干酪的咀嚼性逐渐降低。其中CDF组干酪咀嚼性显著低于CD3组和CCF组干酪，CD3组和CCF组干酪咀嚼性变化趋势相似，除第0、5、6 个月时，其余成熟时间二者咀嚼性差异不显著。CDF组成熟过程中咀嚼性虽显著降低，但下降值不大，在整个成熟期内咀嚼性降低178.298 g，而CD3组和CCF组分别降低799.432、781.279 g。

2.5 切达干酪成熟过程中微观结构的变化

由图5可知，不同凝乳酶和成熟时间对干酪微观结构的影响不同。成熟0 个月时，3 组干酪微观结构都较为致密，CDF组干酪孔洞较大，CD3组干酪次之，CCF组干酪孔洞最小；成熟3 个月时，与CCF组干酪相比，CDF组和CD3组干酪的微观结构较为粗糙和不规则，并且CCF组干酪的微观结构更为致密；成熟6 个月时，3 组干酪微观结构均发生较为明显的变化，随着酪蛋白的水解，干酪结构逐渐融化，酪蛋白基质中孔洞数量急剧增多。这些显微结构上的差异主要是由于地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶和商品凝乳酶蛋白水解能力不同所致，由此可以得出，不同凝乳酶对干酪微观结构的改变不同。

2.6 切达干酪成熟过程中流变特性的变化

干酪具有固体的弹性特征和液体的黏性特征，是典型的黏弹性材料。弹性特征通过G’来描述，黏性特征通过G’’来描述。采用温度扫描实验对3 组干酪成熟过程中流变学特性进行比较分析。

由图6可知，不同成熟时间的干酪G’随温度的变化趋势一致，均随着扫描温度的升高而降低，这是由于温度升高会破坏干酪中的蛋白质基质，削弱分子间的相互作用，导致弹性降低和流动性增加。但随着成熟时间的延长，3 组干酪G’却表现出下降的趋势。这是因为随着干酪的成熟，蛋白质不断被蛋白酶水解，降低了干酪内部结构的完整性，导致成熟过程中G’降低。在不同成熟时间内，CCF组干酪G’均高于CD3组和CDF组干酪，表明CCF组干酪酪蛋白网络结构更致密，其弹性和机械性能优于CDF和CD3组干酪。但当温度大于40 ℃时，CDF组干酪G’最小，表明其流动性和熔融性更好。

由图7可知，随着干酪成熟时间的延长，3 组干酪G’’均呈下降趋势，同时，3 组干酪G’’随温度的变化曲线也有相同趋势，均为随温度的增加而下降。在不同成熟时间内，当温度高于60 ℃时，CCF组干酪G’’同样高于CD3组和CDF组干酪。

tanδ是G’’和G’的比值，其表征干酪融化过程中流动性的变化。当tanδ等于1时，G’’等于G’，此时干酪达到固体和液体的临界点温度，当G’’大于G’时，干酪液体特征占主导，反之固体特征占主导。由图8可知，在成熟期间CDF组干酪tanδ总体高于CD3组和CCF组干酪。3 组干酪样品在温度低于40 ℃时，其tanδ基本保持不变，温度高于40 ℃时增加，60～70 ℃时达到最大值，然后下降。随着干酪成熟度的增加，tanδ变化整体呈下降趋势，这表明在干酪成熟期间其流动性逐渐减弱。

3 讨 论

3.1 凝乳酶对切达干酪质构及微观结构的影响

质地是切达干酪的主要质量属性之一，其变化与成熟过程中发生的物理和化学变化密不可分[17]。本研究中干酪硬度随着成熟时间的延长而增加，这一现象与郑远荣等[18]研究结果一致。成熟过程中硬度随着干酪成熟度的增加可能是由以下2 个因素造成的：首先，干酪脱水后其总固形物含量增加，这将有助于形成更坚硬的干酪基质[19]；其次，随着蛋白质水解作用的继续，可用于蛋白质基质水合的水越来越少，这导致干酪不易变形，从而使硬度增加[20]。此外，有研究表明，小牛、骆驼和微生物来源的3 种凝乳酶在成熟过程中质地变化不同，说明不同凝乳酶对干酪质地的影响不同[21]。本研究中，在成熟第0个月，CCF组和CDF组干酪硬度差异不显著，随着成熟时间的延长，CCF组干酪硬度显著高于CDF组干酪（P＜0.05），这说明凝乳酶类型对硬度有显著影响。此外，随着干酪的成熟，3 组干酪的弹性和咀嚼性呈逐渐减小的趋势。这可能是因为成熟过程中αs1-酪蛋白的酶解使干酪质地变得更软[22-23]。

干酪是由蛋白、脂肪、矿物质和水组成的复杂基质，酪蛋白形成主要的结构网络并包裹脂肪[24]。在生产和成熟期间，干酪的微观结构受许多因素影响，如凝乳pH值、排乳清、发酵剂浓度、凝乳酶类型和浓度、含盐量和成熟期等[25]。有研究表明，在干酪成熟过程中由于蛋白质网络的破坏导致微观结构的变化[26]。在本实验中，酪蛋白形成了一个连续的网络，而脂肪和水分则填充在酪蛋白基质中，蛋白质结构表面的凹痕是干酪中游离脂肪的标志，孔洞和缝隙则是水分的标志。随着成熟期的延长，干酪致密的蛋白网络结构中孔洞数量逐渐增多，网络结构逐渐被解体。在同一成熟时期，由于地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶蛋白水解活性高于商品凝乳酶，CDF组干酪蛋白网络结构更为松散，因此CDF组干酪的熔融性会更好。Soodam等[27]比较微生物凝乳酶Hannilase和重组骆驼凝乳酶生产的低脂切达干酪，监测干酪成熟过程中的微观结构变化，经过31 周的成熟后，用重组骆驼凝乳酶制成的干酪比用微生物凝乳酶Hannilase制成的干酪蛋白质网络致密，这可能是因为重组骆驼凝乳酶蛋白降解率较低，这一结果与本研究相似。

3.2 凝乳酶对切达干酪流变学性质的影响

本研究中3 组干酪的G’都随着温度的升高而降低，Lucey等[28]也观察到类似的结果，在成熟过程中，切达干酪的G’在低温下会增加，但在高温时迅速下降。这是因为温度升高会破坏干酪中的蛋白质基质，削弱分子间的相互作用，导致弹性降低和流动性增加[29]。在整个成熟期内，CDF组和CD3组干酪G’低于CCF组干酪，可能是由于CCF组干酪更为致密的酪蛋白网络增加了干酪的弹性。此外，本研究结果表明，成熟6 个月时，3 组干酪的G’均有下降。Hu Yanan等[30]研究发现，成熟度较高的干酪具有较低的G’，这与本研究结果一致。这是因为随着干酪的成熟，蛋白质不断被蛋白酶水解，这降低了干酪内部结构的完整性，导致成熟过程中G’降低[20]。

本研究中，在不同成熟时间点3 组干酪tanδ变化趋势相似，均为先增大后减小。除在成熟0 个月时tanδ大于1外，成熟3、6 个月时，tanδ均小于1。tanδ等于1被界定为干酪融化的临界点，融化是指干酪流动和扩散的能力。干酪被加热时会失去弹性从而导致软化，干酪在流动之前会变软，但只有当G’大于G’’时流动才会发生。本研究中在温度范围相同时，随着成熟度的增加，干酪tanδ降低，可能与成熟过程中水分含量的降低导致总固体含量增加有关，这与Ray等[19]研究结果相同。干酪的可融性增加与成熟期间的蛋白水解有关[31]。

结合扫描电子显微镜图像和流变特性可知，与CDF组和CD3组干酪相比，CCF组干酪蛋白结构更致密，其G’也高于CDF组和CD3组。Esteves等[32]研究植物凝乳酶和小牛皱胃酶制备的脱脂乳凝胶时也得出同样的结论，在凝乳pH值相同时，凝胶的微观结构中蛋白质网络更致密，样品G’也较高。

4 结 论

对3 组切达干酪成熟过程中质地变化进行分析，TPA分析表明，3 组干酪在成熟过程中质构参数变化趋势相同，CDF组干酪硬度显著低于CCF组，说明地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶所生产的干酪质地更软；扫描电子显微镜图像分析表明，3 组干酪在成熟过程中酪蛋白网络基质逐渐被水解，CCF组干酪在成熟过程中蛋白网络结构更为致密，这说明不同凝乳酶对切达干酪微观结构的影响不同；流变学分析表明，商品凝乳酶生产的干酪样品弹性和机械性能优于地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶生产的干酪，地衣芽孢杆菌D3.11凝乳酶所生产的干酪流动性和熔融性更好。