益生菌包埋晶球的体外耐受性及其应用特性研究

曹珺,刘绒梅,罗力文,孙金威,吴华星,吕雪鹏,高达,李启明,3

(1.乳品营养与功能四川省重点实验室，成都 610000；2.新希望乳业股份有限公司，成都 610000；3.四川省优质乳品制备与质量控制技术工程实验室,成都 610000）

0 引言

益生菌能产生多种活性物质，在肠道微生态平衡的调控及某些疾病的防治中发挥重要作用[1-6]，然而胃酸和肠道胆汁盐、消化酶等体内环境会致其死亡。鼠李糖乳杆菌grx10是一株具有降血脂功能的益生菌，已在发酵乳中进行应用转化[7-9]，但其较强的产酸能力限制了适用产品范围[10]。包埋技术利用高分子材料将物质包裹在网状结构中从而减少内外物质接触，包埋益生菌可以缓解其对外界的影响及恶劣外环境对其造成损害[11-13]。

本研究通过体外模拟实验比较分析了鼠李糖乳杆菌grx10与同样产酸能力较强的副干酪乳杆菌Lpc37[15]在被包埋前后对胃肠道环境的耐受性，考察了含益生菌晶球的酸奶在货架期内pH、酸度和活菌数的变化及末期感官测评，为益生菌包埋技术在酸奶领域的应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）grx10，来自新希望乳业股份有限公司；副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）Lpc37购自丹尼斯克（中国）有限公司。分别包埋grx10和Lpc37的益生菌晶球及实验中所用酸奶均由新希望乳业股份有限公司提供。

1.1.2 试剂

MRS培养基、牛胆盐，广州环凯微生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥1∶3 000），德国BioFroxx；胰蛋白酶（≥50 000 U/g，1∶250，BR），国药集团化学试剂有限公司；0.22μm水系针式过滤器，上海新亚净化器件厂。柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾，均为分析纯。

用PBS缓冲液配制模拟胆盐溶液（含质量分数为0.3%的牛胆盐），按照2020《中国药典》第四版配制人工胃液（含质量分数为1.0%的胃蛋白酶）、人工肠液（含质量分数为1.0%的胰蛋白酶，pH值为6.8）[15]。蛋白酶用0.22μm水系针式过滤器过滤除菌，其余试剂均121℃（15 min）灭菌。

1.2 仪器与设备

BBS-DDC医用洁净工作台，济南鑫贝西生物技术有限公司；INC821C两槽式恒温培养箱，雅马拓科技贸易（上海）有限公司；UPT-I-10T超纯水机，成都超纯科技有限公司；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；MLS-3020高压灭菌锅，松下电器（中国）有限公司；HHS-21-6电热恒温水浴锅，上海博迅实验有限公司医疗设备厂；TA.XTplus物性测试仪，超技仪器有限公司；FiveEasy Plus pH计、T5电位滴定仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 晶球大小、质构及含水率测定

大小：每种晶球随机取10～15颗，用游标卡尺测量其直径，求平均值。

硬度：将单颗晶球放置在质构仪测试台中央，使用A/BE探头，直径=35 mm，探头移动速率=1.00 mm/s，触发力=5.0 g，随机测定10～15颗晶球硬度，求平均值。

含水率：取一定量的晶球置于105℃烘箱烘至恒重并记录。含水率计算公式为：

式中：M1为烘干前质量；M2为烘干后质量。

1.3.2 活菌数测定

益生菌晶球：取一定量晶球，先用浓度为60 mmol/L柠檬酸钠溶液[16]溶解，再参照《GB4789.35-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》检测活菌数。

益生菌粉：参照《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》检测活菌数。

1.3.3 存活率比值

通过比较益生菌晶球和益生菌粉经模拟消化后的存活率比值研究包埋处理对菌株抵御胃肠道环境效果的影响。存活率比值计算公式为：

式中：A1为益生菌晶球经消化后活菌数；A0为益生菌晶球初始活菌数；B1为益生菌粉经消化后活菌数；B0为益生菌粉初始活菌数。

1.3.4 模拟胃液消化

人体胃液pH值通常在3.0左右，空腹时在2.0左右[17]，消化时间通常为2～3 h[18-19]。本研究选择2.0、2.5和3.0 3个pH值以及1.0、2.0、3.0 h 3个时间点进行模拟胃液实验验证益生菌耐酸性。

益生菌晶球：将益生菌晶球置于10 mL注射器中，模拟口腔咀嚼进行挤压破碎，然后分别称取1.0 g晶球碎块加到pH值为2.0、2.5、3.0的19 mL人工胃液中进行模拟消化处理，分别消化1.0、2.0、3.0 h后，滤掉消化液并用生理盐水清洗晶球表面1次，按照

1.3.2 方法测定活菌数，每组3个平行。

益生菌粉：将益生菌冻干粉溶于生理盐水，制成与晶球中的益生菌具有相同数量级的菌粉溶液。分别取1.0 g菌粉溶液加到pH值为2.0、2.5、3.0的19 mL人工胃液中进行模拟消化处理，分别消化1.0、2.0、3.0 h后，测定活菌数，每组3个平行。

1.3.5 模拟胆汁与肠液消化

食物在小肠内停留时间比在胃中长，约3～8 h[20]。食物过胃后进入十二指肠，胆汁和胰液在此被注入，小肠内胆盐的质量分数在0.3%左右[21]。本研究分别探索益生菌在模拟胆盐和人工肠液中的存活情况。分别用模拟胆盐溶液和人工肠液，取1.5、3.0、4.5 h 3个时间点，按照1.3.4对益生菌晶球和益生菌粉进行消化实验。

1.3.6 益生菌晶球酸奶货架期性质跟踪

以市售新希望某原味酸奶作为对照，添加质量分数为6%的益生菌晶球至原味酸奶中制成益生菌晶球酸奶，分别监测对照组酸奶与益生菌晶球酸奶21 d货架期内pH、酸度、活菌数及末期的感官性质。由新希望乳业股份有限公司科技研究院感官品评团队和消费者共100人参与感官测评，测评标准如表1所示。

表1 感官评价评分标准

(续表1)

1.3.7 数据统计

采用Excel 2016软件进行数据统计分析和绘图；以SPSS Statistics 20进行方差分析（ANOVA），显著水平设定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 胃肠道环境中晶球对益生菌的保护效果

2.1.1 晶球大小、质构及含水量

将包埋了益生菌的非干燥透明球称为“益生菌晶球”，晶球的主要成分为一种或多种具有离子凝胶性质的食品胶体[22]，图1为益生菌晶球示意图。

图1 益生菌晶球示意图

分别包埋鼠李糖乳杆菌grx10，副干酪乳杆菌Lpc37的两种益生菌晶球的直径、硬度、含水量测定结果如表2所示。由表2可知，实验所用两种益生菌晶球的基本性质无统计学差异（P＞0.05）。

表2 包埋不同益生菌的晶球的基本性质

2.1.2 对人工胃液的耐受性

益生菌需通过胃酸屏障以活菌形式到达肠道来发挥作用，因此本研究的益生菌晶球应在人工胃液中不溶解、不破碎，保证顺利到达肠道释放包埋益生菌。分别包埋grx10和Lpc37的晶球与对应菌粉在不同pH值的人工胃液中消化1.0、2.0、3.0 h后的活菌数结果如图2所示。

图2 不同pH值的人工胃液对益生菌晶球和菌粉活菌数的影响

grx10和Lpc37的晶球和菌粉经pH值为2.0的人工胃液消化1.0 h后活菌数均小于10 g-1（图中未展示）。由图2可知，经pH值为2.5的人工胃液消化2.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌数分别提高了3.5和5.8个数量级，存活率分别是3 167和696 398倍（P＜0.05）；消化3.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌数分别提高了4.4和5.2个数量级，存活率分别是27 959和152 432倍（P＜0.05）。经pH值为3.0的人工胃液消化2.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌数分别提高了1.5和3.2个数量级，存活率分别是34和1466倍（P＜0.05）；消化3.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌数分别提高了1.6和3.6个数量级，存活率分别是39和3 877倍（P＜0.05）。可见，晶球包埋能显著提升益生菌grx10和Lpc37对人工胃液的耐受性，提升效果与被包埋菌株种类有关，由图可知grx10耐酸能力优于LPC37，包埋对耐酸能力较弱益生菌的提升更显著。另外各组中益生菌晶球在人工胃液消化中仅变软不溶解，可顺利到达肠道进行释放。

2.1.3 对胆盐的耐受性

食物过胃后进入十二指肠与具有抑菌作用的胆盐接触，胆盐会破坏细胞膜造成细胞死亡，因此需要评估益生菌对高浓度胆盐的耐受能力[23]。分别含grx10，Lpc37的晶球和菌粉在质量分数为0.3%胆盐溶液中消化1.5，3.0，4.5 h后的活菌数如图3所示。

图3 质量分数0.3%的胆盐对益生菌晶球和菌粉活菌数的影响

由图3可知，经质量分数0.3%的胆盐溶液消化3.0 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌数分别提高了3.9和1.1个数量级，存活率分别是7 229和13倍（P＜0.05）；消化4.5 h后，grx10和Lpc37晶球相比菌粉活菌数分别提高了4.2和1.7个数量级，存活率分别是16 347和52倍（P＜0.05）。表明晶球包埋使grx10和Lpc37对胆盐的耐受性得到显著提升。同样，晶球包埋对益生菌胆盐耐受能力的提升效果因被包埋菌株种类而不同，对耐胆盐能力较弱益生菌的提升更显著。

2.1.4 对人工肠液的耐受性

分别含grx10和Lpc37的晶球和菌粉在人工肠液中消化时间分别为1.5，3.0，4.5 h后的活菌数如图4所示。

由图4可知，经4.5 h人工肠液消化后，晶球和菌粉中grx10和Lpc37的活菌数均保持在108g-1范围，grx10和Lpc37晶球中菌株存活率相比菌粉分别为1.45和1.80倍，无统计学差异（P＞0.05）。可见，grx10和Lpc37菌株本身对人工肠液具有良好的耐受性，经晶球包埋后仍能维持其在肠液中的活菌数。

肠溶性结果表明，益生菌晶球在人工肠液中持续震荡处理3.0 h可完全溶解，且在前述人工胃液和模拟胆汁盐溶液中晶球仅会变软不会溶解，说明益生菌晶球可穿过胃和十二指肠在肠道中释放益生菌。

图4 人工肠液对益生菌晶球和菌粉活菌数的影响

2.2 晶球在酸奶中的应用

市售酸奶在生产和销售过程中需要符合《GB 19302-2010食品安全国家标准 发酵乳》中的规定，且在21 d货架期间产品的风味、质构等感官特性应无显著变化。常见问题之一是酸奶的后酸化现象，一些益生菌（例如grx10和LPC37）代谢产酸能力较强，在低温条件下仍会继续代谢产生例如乳酸、乙酸等有机酸，可能会对发酵乳的风味和质构产生影响，因而需对添加益生菌晶球的酸奶的pH值、酸度、活菌数和感官指标进行测评。

2.2.1 酸奶pH值和酸度变化

为了研究益生菌晶球与酸奶混合后是否会导致产品在货架期内后酸化严重，测定了添加/不添加益生菌晶球的酸奶的pH值和酸度，结果如图5和图6所示。

图5 添加/不添加益生菌晶球的酸奶的货架期pH值变化

图6 添加/不添加益生菌晶球的酸奶的货架期酸度变化

由图5和图6可知，添加益生菌晶球的酸奶在21 d低温（4℃）贮藏中，酸奶部分的pH值、酸度变化与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。21 d内三者pH值从4.40左右下降至4.15左右，酸度从90.00°T左右上升至94.00°T左右。贾庆超[24]等对两种市售酸奶进行货架期性质跟踪发现，4℃密封冷藏21 d的两种酸奶的酸度分别增加4.3°T和5.0°T，蔡超[25]也比较了两种市售酸奶（光明和蒙牛）在5℃下贮藏21 d的酸度变化，酸度分别增加6.48°T和8.73°T，杜磊[26]等发现市售蒙牛原味酸奶在4℃下贮藏21 d后酸奶的酸度从74.3°T升至108.8°T，升高了34.5°T。对比可知，实验所用原味酸奶的货架期后酸化程度弱、贮藏稳定性好，且益生菌晶球的添加没有导致过酸影响酸奶品质。刘绒梅[10]等对grx10的货架期pH值和酸度变化研究表明其是一株后酸能力较强的乳酸菌，同样郭小[14]等研究中也表明LPC37的产酸能力较强，但在本研究中晶球包埋处理显著抑制了两种益生菌的后酸化现象，可见益生菌经包埋后与外环境营养物质的接触减少，基本不对外环境造成影响。因此，在酸奶中添加益生菌晶球能在增加产品益生菌含量的前提下，保持酸奶原有良好风味。

2.2.2 酸奶和晶球中活菌数变化

为了研究益生菌晶球与酸奶混合后的产品在货架期的稳定性，分别测定了益生菌晶球酸奶中酸奶部分与晶球中的菌含量，结果如图7所示。

图7 晶球酸奶货架期内酸奶部分与晶球中活菌数的变化

由图7可知，21 d货架期内，添加/不添加益生菌晶球的酸奶部分中的活菌数无显著差异，均呈现先增长后下降的趋势，第7天时活菌数上升约0.05个数量级，至第21 d下降约0.5个数量级，可见益生菌晶球的添加不影响酸奶部分的菌含量。并且两种晶球中的活菌数基本保持不变，下降均不足0.1个数量级，可见酸奶的浸泡也不会对晶球中菌含量产生不良影响。由上述可知，晶球能够起隔离内外环境的作用，晶球中的益生菌被充分包埋，未泄露到外环境中，晶球中益生菌数量长时间保持不变。因此，与传统酸奶相比，含益生菌晶球的酸奶能在保证美味的前提下提供更多数量的活性益生菌。

2.2.3 酸奶感官品评

不添加晶球的原味酸奶与分别添加两种晶球的晶球酸奶的感官品评结果如见图8所示。

由图8可知，分别添加了grx10晶球、Lpc37晶球的两种酸奶口感、滋味、气味、组织状态与无晶球酸奶（原味酸奶）相比无明显差异，但Q弹的晶球带来的咀嚼感提升了品评者对酸奶的整体喜爱度，可见益生菌晶球不但不会影响酸奶的品质，且通过良好的咀嚼体验感提升了消费者对产品的青睐。

图8 添加/不添加益生菌晶球的酸奶的感官品评结果

3 结论

通过对鼠李糖乳杆菌grx10、副干酪乳杆菌Lpc37包埋前后的体外耐受性进行比较研究发现：经pH值为2.5的人工胃液最长处理3.0 h后，grx10和Lpc37经包埋后的活菌数与包埋前相比分别提升4.4和5.2个数量级，存活率分别为27 959和152 432倍；经质量分数为0.3%的胆盐溶液最长处理4.5 h后，grx10和Lpc37经包埋后的活菌数与包埋前相比分别提高了4.2和1.7个数量级，存活率分别为16 347和52倍。另外grx10和Lpc37均对人工肠液具有较好耐受性，晶球包埋后不改变该性质且能完全溶于人工肠液。综合可知，晶球包埋可以提高grx10和Lpc37对人工胃肠液及胆盐的耐受性，且能在胃液、胆汁中保持不溶解、不破碎的状态进入肠液释放益生菌。

通过测定添加/不添加益生菌晶球的酸奶的货架期pH值、酸度、活菌数及感官特性可知，添加益生菌晶球不仅不会影响酸奶的pH值、酸度及活菌数，还能避免产酸能力较强益生菌造成的后酸化影响，另外咀嚼感良好的晶球提升了产品的趣味性和消费者的喜好度。综上，晶球能够起隔离内外环境的作用，益生菌被晶球充分包埋不外泄，稳定性好，能在增加产品益生菌含量的前提下保持酸奶原本的良好风味。