基于代谢组学研究乳酸菌素片对腹泻小鼠的干预作用机制

2022-06-30杨妮詹扬万建华李颖萌刘文君

中国乳品工业 2022年6期

杨妮，詹扬，万建华，李颖萌，刘文君

(江中药业股份有限公司,南昌 330004)

0 引言

抗生素是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的有效药物，日常生活中抗生素的不恰当使用带来许多严重的并发症，如抗生素耐药、抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea,AAD)等，已经引起了临床的广泛关注[1-2]。AAD作为抗生素使用的常见副作用之一，影响5%～70%使用抗菌药物的成年患者[3]。因此，寻找解决AAD的替代药物成为人们关注的焦点。后生元是对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂[4]。乳酸菌素作为一种后生元制剂，由纯乳酸菌代谢产生，将脱脂乳经过杀菌和真空浓缩，再由乳酸菌发酵后干燥而制成，是改善肠道环境和调节肠道功能的传统药物，具有安全性高、易储存和热稳定性等优点[5-6]。前期研究发现乳酸菌素片能通过调节肠道菌群，有效改善小鼠的腹泻症状[6]。代谢组学是近年来兴起的从排泄物样本(血浆或尿液等)中识别代谢标志物的组学技术平台。生物样品中的代谢产物有助于反映机体病理生理变化，对其定性定量检查为疾病和药物作用机制的研究提供了比传统研究方法更为丰富全面的信息[7-8]。因此，本研究预利用基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS的代谢组学分析方法，研究乳酸菌素片对腹泻小鼠血清代谢产物的影响，深入探究乳酸菌素片干预腹泻的代谢通路和可能机制，为临床应用提供新的着眼点。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 实验动物

SPF级雄性昆明小鼠24只，体重20±2 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证编号：SCXK(翔)2019-0004。小鼠在江中药业实验动物中心饲养，适应性喂养一周，自由进食饮水。

1.1.2 试剂与药物

乳酸菌素片(批号：19070012，每片含乳酸菌素0.4 g)，江中药业股份有限公司；硫酸庆大霉素(批号：20190122，含量≥590 U/mg)，福安药业集团烟台只楚药业有限公司；盐酸林可霉素(批号：20180818，含量≥90%)，河南新乡华星药厂。甲醇、乙腈、甲酸、丙醇和纯水均为色谱级，美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 仪器与设备

超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC-Q Exactive HF-X，赛默飞公司；HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8μm)，美国Waters公司；JXDC-20型氮气吹扫仪，上海净信实业发展有限公司；LNG-T88型台式快速离心浓缩干燥器，太仓市华美生化仪器厂；SBL-10TD型超声波清洗机300W-10L，宁波新芝生物科技股份有限公司；Centrifuge 5430R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；NewClassic MF MS105DU型电子天平，瑞士梅特勒公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立

小鼠灌胃硫酸庆大霉素和盐酸林可霉素的混合溶液(1∶1,0.4 g/mL)，0.5 mL/只，每日2次，连续5 d，当小鼠粪便呈现软湿，黄绿色水样便，说明造模成功[9]。

1.2.2 分组及给药

将造模成功的小鼠随机分为模型组和乳酸菌素片组(n=8)，其余未处理为正常对照组。乳酸菌素片组给药剂量(按乳酸菌素计)为：每天1.2 g/kg，每天灌胃2次，每次0.5 mL。空白组和模型组灌胃等量的无菌水，每天2次，连续给药10 d。

1.2.3 标本采集与处理

小鼠每5天称重一次。给药结束时，根据之前的研究[10]，采用腹泻评分来评估各组小鼠腹泻的严重程度，评分标准为：0分(正常大便)；1分(轻度腹泻伴湿软便)；2分(中度腹泻伴有未成形大便，轻度肛周染色)；3分(严重腹泻伴水样便和严重的肛周染色)。禁食12 h后，各组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.6 mL/100 g)，腹主动脉取血至无抗凝剂的采血管中，静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，收集上层血清，-80℃保存。无菌条件下立即取出盲肠，将盲肠结扎后剪下称重，游标卡尺精确测量盲肠长度，取出盲肠内容物后盲肠称重，利用2次称重差值计算盲肠内容物含量。盲肠指数和盲肠内容物指数计算公式如下[11-12]:

1.2.4 UPLC-MS检测分析

（1）血清样品前处理。将冻存的血清于37℃复融2 min，取100μL液体样本于2 mL离心管中。400μL提取液(甲醇∶水=4∶1(体积比))含0.02 mg/mL的内标(L-2-氯苯丙氨酸)进行代谢产物提取。样本溶液于冷冻组织研磨仪研磨6 min(-10℃，50 Hz)，后低温超声提取30 min(5℃，40 kHz)。将样品静置于-20℃，30 min，离心15 min(4℃，13 000g)，移取上清液至进样瓶中进行上机。

（2）色谱条件。采用HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)；柱温40℃。流动相A为5%乙腈水(含0.1%甲酸)，流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸)。梯度洗脱：0～3.5 min，0～24.5%B，流速0.40 mL/min；3.5～5 min，24.5%～65%B，流速0.4 mL/min；5～5.5 min，65%～100%B，流速0.4 mL/min；5.5～7.4 min，100%B，流速0.4 mL/min升至0.6 mL/min；7.4～7.6 min，100%～51.5%B，流速0.6 mL/min；7.6～7.8 min，51.5%～0%B，流速0.6 mL/min降至0.5 mL/min；7.8～9 min，0%B，流速0.5 mL/min降至0.4 mL/min；9～10 min，0%，流速0.4 mL/min。

（3）质谱条件。样品质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质谱扫描质荷比范围m/z：70～1050。离子喷雾电压，正离子电压3 500 V，负离子电压2 800 V，辅助加热气10 psi，离子源加热温度为400℃，20-40-60 V循环碰撞能，MS1分辨率70 000，MS2分辨率17 500。

1.2.5 数据处理及分析

LC-MS原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正等处理后得到数据矩阵，将其进行缺失值和归一化处理，同时删除QC样本相对标准偏差(RSD)＞30%的变量，并进行log10对数化处理，得到最终用于后续分析的数据矩阵。将MS和MS/MS质谱信息与代谢公共数据库HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)数据库进行匹配，得到代谢物信息。R软件包ropls(Version1.6.2)进行PCA和OPLS-DA分析。显著差异代谢物的选择基于OPLS-DA模型得到的变量权重值(VIP)和student’s T检验p值来确定。通过KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行的代谢通路注释，获得差异代谢物参与的通路。Python软件包scipy.stats进行通路富集分析，并通过Fisher精确检验获得与实验处理最相关的生物学途径。

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，经方差齐性检验后，两组间比较采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析。各组结果均用平均值±标准差(mean±SD)表示，P＜0.05表示结果具有统计学差异，P＜0.01则表示结果有极显著统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌素片对小鼠体重、腹泻评分、盲肠长度及盲肠指数的影响

与正常组相比，模型组和乳酸菌素片组小鼠在给予抗生素造模后，体重均呈现缓慢升高趋势，至给药10 d结束时，模型组和乳酸菌素片组小鼠的体重均显著低于正常组(P＜0.05)，两组之间无统计学差异(P＞0.05)，如图1（a）所示。腹泻评分结果显示，造模5 d后模型组和乳酸菌素组的腹泻评分均升高，提示抗生素诱导的腹泻模型造模成功。随着给药时间延长，腹泻评分逐渐降低，给药10 d时，乳酸菌素组的腹泻评分降低至接近正常水平，如图1（b）所示。盲肠长度和盲肠指数结果显示，给药10 d后，与正常组相比，模型组盲肠长度和盲肠指数均显著升高(P＜0.05)，而与模型组相比，乳酸菌素组的盲肠长度显著降低趋近于正常组(P＜0.05)，盲肠指数降低无显著性差异，如图1（c）、图1（d）所示。

图1 乳酸菌素对小鼠体重、腹泻评分、盲肠长度和盲肠指数的影响

2.2 小鼠血清代谢轮廓分析

采用UPLC-TOF/MS进行样本的分离和数据采集，各组小鼠在正、负离子模式下的总离子流质谱图如图2。由图2可知，各组分在正负离子模式下均能较好分离，各组之间的保留时间、峰面积有一定差异。

2.3 血清代谢组学的初步分析

基于阴性和阳性模式下获得的血清样本代谢谱数据，对不同组之间的差异进行PCA分析，如图3（a）、图3（b）所示，各组数据的聚类较好，组间分布距离较远，表明模型组和乳酸菌素片组的粪便代谢组发生了显著的变化。对小鼠血清样本进一步采用PLSDA分析，结果显示正离子模式下有3个主成分：R2X=0.468，R2Y=0.968，Q2=0.916；负离子模式下有3个主成分，R2X=0.363，R2Y=0.941，Q2=0.886，如图3（c）、图3（d)。从PLS-DA得分图中可以看出在正离子和负离子模式下空白组、模型组和乳酸菌素片组聚类明显，各组之间显著分离。为进一步验证模型的可靠性和稳定性，对数据模型进行200次的置换检验验证，如图3（e）,图3（f）所示，R2值始终在Q2值之上，且Q2回归直线与纵坐标截距为负数，表明未出现过拟合现象，模型可靠图3（e）,图3（f）。

2.4 差异代谢物筛选

为筛选乳酸菌素片干预腹泻小鼠后的显著性差异代谢物，本研究采用OPLS-DA模型中的第一主成分VIP值＞1，各组之间的粪便代谢物Students’s T检验(T-test)中P＜0.05，并以变异倍数FC＞1.2或＜0.8为标准，共鉴定出潜在生物标志物16个，其中9个上调，7个下调，如表1～2所示，结果提示小鼠灌胃抗生素后，体内的部分代谢产物水平相比于正常组发生了显著变化，灌胃乳酸菌素片10 d后，这些显著性变化的代谢产物大多表现出趋于正常水平的变化趋势，它们主要包括5-羟基-6-甲氧基吲哚葡糖苷酸、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、乙酰半胱氨酸、2，8-二羟基喹啉-β-d-葡萄糖醛酸苷、N-果糖基蒜氨酸和胆红素等，筛选出的这16个差异代谢产物也可以作为AAD的潜在生物标志物。

图2 小鼠血清在正离子模式(1)和负离子模式(2)下的总离子流图

图3 乳酸菌素片对AAD小鼠干预前后血清代谢物的模式判别图

表1 血清中差异代谢物的筛选

表2 基于UHPLC-MS的潜在差异代谢物鉴定

（续表2）

2.5 代谢通路分析

利用MetaboAnalyst软件对16个差异性代谢物进行代谢通路分析，使用KEGG数据库，将Impact≥0.001作为潜在的关键代谢通路，如表3、图4所示，共得到6条代谢通路与乳酸菌素片缓解腹泻症状密切相关，分别为半胱氨酸和蛋氨酸代谢、硫代谢、甘油磷脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化、卟啉和叶绿素代谢和谷胱甘肽代谢。与我们的研究结果一致，前期一项关于白头翁汤治疗湿热腹泻的代谢组学结果发现，差异代谢物主要参与戊糖和葡萄糖醛酸的转化、甘油磷脂代谢和色氨酸的代谢等[13]。甘油磷脂作为哺乳动物细胞膜上的主要结构脂类，调节运输和信号转导，调节蛋白质功能。磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)参与生物膜特别是类囊体膜的构建，通过与蛋白的相互作用，调节各种代谢活动[14]。磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)作为一种广泛用于国内外的营养补充剂，具有改善记忆和认知、缓解精神压力等作用[15]。在我们的研究中，模型组的PG和PS显著升高，而乳酸菌素片治疗后降低了PG和PS含量。因此，乳酸菌素片治疗腹泻与甘油磷脂代谢有关，但是乳酸菌素片治疗后PG和PS含量的降低可能是由于调节甘油磷脂代谢通路中，PG和PS部分的通路因子差异或者腹泻本身的模型差异造成，后期需要深入研究。同时，模型组小鼠体内葡萄糖醛酸苷水平显著降低，乳酸菌素片治疗后显著增加了葡萄糖醛酸苷的水平，其属于戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化，与碳水化合物的代谢有关[13]。此外，肠道氨基酸代谢具有重要的生理和营养功能，包括提供能量、维持肠黏膜细胞的数量及其吸收、防御、细菌屏障和免疫功能等[16]。与模型组相比，乳酸菌素片给药后，乙酰半胱氨酸含量显著升高，表明乳酸菌素片激活了半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径，增加了蛋氨酸的消耗，使其更多的用于半胱氨酸的生成途径，进而增强机体的抗氧化能力，改善肠道功能。因此，我们推测乳酸菌素片治疗腹泻的机制可能与调节碳水化合物代谢、甘油磷脂代谢和氨基酸代谢等有关。