2018-2020年本院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的产酶情况及耐药性分析

刘敏娟 庞彩莲 吴品 陈凯妮 黄嘉莹

铜绿假单胞菌（PA）作为非发酵革兰阴性菌之一，是临床较为常见的条件致病菌，其感染的防治是一直是临床工作的难点[1]，尤其是对于难治性PA，碳青霉烯类抗菌药物仍然是优先考虑的用药方向，随着亚胺培南等碳青霉烯类抗生素的广泛应用，细菌产生一类能广泛水解β-内酰胺类抗生素的碳青霉烯酶，包括丝氨酸酶和金属酶，导致多重耐药等现象日趋严重[2]，因此耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CRPA）的检出越来越普遍。分析东莞市大朗医院2018-2020年CRPA的产酶情况及其耐药性，以及其临床分布、标本来源、患者因素等，临床根据药敏试验合理选择抗菌药物可防止CRPA的蔓延及传播。

1 资料与方法

1.1 标本来源

选自东莞市大朗医院2018年1月-2020年12月，临床住院及门诊患者送检标本检出的465株PA，其中检出CRPA 66株，包括痰液、血液、伤口分泌物、脓液、尿液等标本来源。同一患者重复株已经剔除。

1.2 菌株鉴定及药敏试验

严格按照《全国临床检验操作规程》进行细菌的分离培养，使用法国生物梅里埃公司的VITEK2-Compact细菌鉴定仪和其系统配套的鉴定药敏卡进行鉴定药敏试验，并采用纸片扩散法（K-B法）进行部分药敏试验的补充，抗菌药物的补充纸片来自英国OXOID公司。药敏试验结果采用2021年CLSI M100标准判断。

1.3 PA产碳青霉烯酶及其表型检测

采用2018年CLSI推荐的eCIM试验检测CRPA是否产碳青霉烯酶[3-4]。取 10 μl纯菌落于 2 ml TSB肉汤中，放入含10 μg美罗培南的无菌纸片，35 ℃孵育 4 h±15 min，制备 0.5 麦氏的大肠埃希ATCC 25922菌悬液涂布于MHA平板，将美罗培南纸片取出贴于MHA平板上，35 ℃孵育过夜后判读结果，美罗培南抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm，判断碳青霉烯酶阳性，质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706。碳青霉烯酶表型检测：采用纸片扩散法，制备0.5麦氏菌悬液，涂布于M-H琼脂平板上，张贴4张亚胺培南（10 μg/片）药敏纸片，纸片中心距离≥25 mm，在其中三张纸片上分别滴加10 μl EDTA 溶液、10 μl 3- 氨基苯硼酸溶液 10 μl EDTA溶液+10 μl 3-氨基苯硼酸溶液，35 ℃培养过夜后判读结果。若含EDTA溶液抑制剂的亚胺培南抑菌圈直径与单药相差≥5 mm以上，该菌株产生金属β内酰胺酶，若含3-氨基苯硼酸抑制剂的亚胺培南抑菌圈直径与单药相差≥5 mm以上，该菌株产丝氨酸酶。

1.4 质控菌株

大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853由广东省临床检验中心提供。肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1705（产酶阳性株）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA 1706（产酶阴性株）购买于温州康泰公司。

1.5 统计学处理

同一患者重复分离菌株，仅取初次分离菌株进行分析。采用WHONET 5.6软件进行统计分析。

2 结果

2.1 标本来源构成

2018-2020年本院临床送检的标本共检出465株铜绿假单胞菌，其中CRPA检出率为14.2%（66/465），标本来源以呼吸道痰液为主，共43株，伤口分泌物6株，脓液5株，血液3株，尿液3株，其他分泌物1株，见表1。

表1 66株CRPA标本来源构成比

2.2 标本临床分布

66株CRPA分布于重症医学科（ICU）16株、普通病房50株，CRPA科室检出率排行前三的是：ICU 16株（24.2%）、呼吸内科13株（19.7%）、烧伤科10株（15.15%），具体分布情况见图1。

图1 66株CRPA在临床科室分布构成

2.3 66株CRPA碳青霉烯酶表型检测结果

66株CRPA碳青霉烯酶表型检测结果中产碳青霉烯酶的构成比为33.3%，不产酶的构成比为66.7%，见表2。

表2 66株CRPA碳青霉烯酶表型检测结果

2.4 66株CRPA耐药率

66株CRPA的药敏结果中亚胺培南和美罗培南的耐药率较高分别为97.0%和71.2%，其次为氨曲南51.5%，其余耐药率均＜30%，哌拉西林为27.3%，哌拉西林/他唑巴坦为22.7%，头孢他啶16.7%，头孢吡肟12.1%，环丙沙星12.1%，左旋氧氟沙星及氨基糖苷类耐药率均＜10%，见表3。

表3 66株CRPA耐药性分析结果[株（%）]

3 讨论

PA是一种革兰阴性的不发酵糖类的阴性杆菌，是临床常见的条件致病菌，其具有易变异、定植、耐药等特点，随着碳青霉烯类药物的广泛使用，出现CRPA逐年增长。

从2018-2020年临床送检标本中共分离465株PA，其中CRPA 66株，检出率14.2%，略低于2020年广东省耐药菌监测及质量控制中心的CRPA耐药率数据（15.7%），高于余建洪等[5]结果（9.8%），低于2014-2019年全国细菌耐药监测网细菌耐药性监测报告中的CRPA检出率为18.2%～21.0%[6]。本院CRPA检出率均比全国水平低，这可能是与医院级别相关、2020年疫情的影响门诊及住院患者减少等原因相关。

在66株CRPA中，痰液标本43株，占65.2%，伤口分泌物6株，占9.1%，次之是脓液5株，占7.6%。标本来源以呼吸道痰液、伤口分泌物为主，与Guo等[7]研究结果一致，感染高发部位以呼吸道感染为主，这可能是与细菌含有荚膜多糖能抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于致病菌黏附于呼吸道细胞表面、呼吸道与外界相通、菌群失调、患者免疫力下降、呼吸道样本占比较高等相关[8]。在66株CRPA科室分布中，前三位是ICU 16株，占24.2%，呼吸内科13株，占19.7%，烧伤科10株，占15.2%。CRPA主要以重症和慢性疾病患者为主。ICU患者具有病情危急危重、免疫功能低下、机械通气使用频繁、手术治疗、住院时间较长、长时间使用青霉烯类抗生素或者联合用药等特点，有研究表明，入住ICU超过3 d的患者其CRPA的发生率会明显增加[9]。呼吸科患者主要有基础疾病、抵抗力较差、病情较长、年龄偏大等特点，加之同样频繁住院及大量广谱抗生素的应用，使得感染概率也有所增加[10]。而烧伤患者因皮肤屏障功能遭受破坏，导致体内水分、蛋白质、电解质等的丢失，微生物可经烧伤创面侵入局部或全身引起感染，研究显示，PA是烧伤患者医院感染的最常见病原体之一[11]，尤其是烧伤重症感染时，多选用具有抗菌活性较强、显著的治疗效果、对酶稳定性较高及不良反应较少的新型的β-内酰类的碳青霉烯类抗菌药物，随着临床使用的日益频繁，细菌耐药性也有所增高，CRPA出现逐年上升的趋势[12]。

在66株CRPA碳青霉烯酶表型检测结果中，产碳青霉烯酶共22株，占33.3%，其中单一产丝氨酸酶为16.7%，单一产金属酶为12.1%，同时产丝氨酸酶+金属酶为4.5%，不产碳青霉烯酶为66.7%。本院中产碳青霉烯酶只是PA对碳青霉烯类耐药的机制之一，不是对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制，与刘涛等[13]报道相似。这可能是PA固有耐药性、外膜蛋白Opr-D2缺失、非特异外排泵高表达作用、外膜通透性降低等导致细菌耐药。其次，不合理使用抗菌药物及医疗机构感染预防与控制措施不当导致。

CRPA是指铜绿假单胞菌对碳青霉烯类亚胺培南或美罗培南任何一种药物耐药，亚胺培南耐药率比美罗培南高，药敏结果显示，66株CRPA对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为97.0%和71.2%，并且亚胺培南耐药率高于美罗培南。这可能与PA对这两种抗生素耐药机制上不同所导致，PA对美罗培南的耐药机制主要是以外排泵高表达为主，同时也受OprD基因下调影响[14]，而PA对亚胺培南耐药机制更为复杂，除OprD基因突变和缺失为主外，产生最常见的金属β-内酰胺酶也是其中之一，另外还存在外排泵高表达、产AmpC酶等耐药机制[15]。另外也可能与药物使用频度有关，有研究表明，碳青霉烯类药物的频繁使用会对亚胺培南及美罗培南的耐药率存在正相关[16]。其次为除氨曲南51.5%外，其余耐药率均＜30%，哌拉西林为27.3%，哌拉西林/他唑巴坦为22.7%，头孢他啶16.7%，头孢吡肟12.1%，环丙沙星12.1%，左旋氧氟沙星9.1%，庆大霉素9.1%，妥布霉素9.1%，最低的耐药率是阿米卡星4.5%，与王琼琼等[17]研究相近，因此阿米卡星可作为临床治疗CRPA的首选药物。对于氨基糖苷类药物耐药率较低的原因可能是它与其他抗菌药物相比不良反应较大，因此临床使用率减少，从而降低耐药性，其次是临床上主要将它与β-内酰胺类药物一起联合使用，使其耐药性的产生减慢[18-19]。

有研究显示，目前导致CRPA的耐药机制尚未明确，有可能与以下几种原因相关：（1）CRPA能产生如β-内酰胺酶或氨基糖苷钝化酶等抗菌活性酶。（2）CRPA可能改变抗菌药物作用的靶位，如DNA旋转酶等结构发生改变，达到逃避抗菌药物的效果。（3）外膜通透性降低、生物膜形成及外源耐药基因等[20-21]。

综上所述，CRPA具有多种天然和获得耐药机制，且耐药机制复杂，临床治疗非常困难，因此，临床治疗方案上应依据不同病区、不同感染来源，根据药敏试验合理选择抗菌药物进行个体化治疗，可有效防止CRPA的蔓延及传播。