1例人血源性嗜低温弓形菌的分离鉴定与文献复习*

贾 静，郭明发，徐 璐，杨俊文，杨俊梅

郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院检验科，河南郑州 450000

嗜低温弓形菌属于弓形菌属，隶属于细菌域、变形菌门、ε-变形菌纲、弯曲菌目、弯曲菌科，目前属内已鉴定出25个物种[1]。弓形菌在需氧和厌氧环境中均可生长，革兰染色阴性，菌体呈弯曲或“S”形杆菌。弓形杆菌是一种重要的食源性人畜共患病原体，常见的菌种主要有嗜低温弓形菌、布氏弓形菌、硝化弓形菌和斯氏弓形菌[2-3]。对该致病菌的快速鉴定与甄别可为患者诊断和有效治疗做出迅速处理。因此，本研究对2018年在河南省儿童医院就诊的1例溺粪患者发生血源感染后分离的细菌进行鉴定，以期对该类细菌引起疾病的诊治提供帮助。

1 资料与方法

1.1一般资料 患儿女，1岁3个月，因“溺粪、心肺复苏术后75 min”急诊入院。患儿75 min前玩耍时溺粪，3～4 min后家属发现患儿面部朝上，伴青紫明显，意识丧失；立即给予清理呼吸道、拍背、胸外按压等治疗后送至当地县人民医院，给予“气管插管”及“胸外按压”等抢救治疗，未见明显好转，遂由当地120送入本院。急诊科以“溺水、呼吸衰竭”收入院。入院查体：体温35.5 ℃，脉搏50次/分，心音极低，心率50次/分，呼吸30次/分，血压53/26 mm Hg。血氧饱和度(SPO2)79%，浅昏迷，全身皮肤无黄染、出血点及紫癜，双侧瞳孔等大等圆，直径4 mm，对光反射迟钝，复苏囊加压给氧下口唇发绀明显，四肢肌张力低，膝腱反射消失，布鲁金斯氏征阴性，双侧巴氏征阴性，双侧克氏征阴性，四肢末梢凉，毛细血管充盈时间(CRT)>5 s。颈软，双肺呼吸音低，可闻及密集细湿性啰音，未闻及明显病理性杂音。腹膨隆明显，腹软，肝脾肋下未触及，未触及包块，肠鸣音弱。入院实验室检查：白细胞计数16.59×109/L，中性粒细胞百分比3.4%，淋巴细胞百分比94.4%，C-反应蛋白定量0.80 mg/L；肌酸激酶同工酶11.01 ng/mL，B型钠尿肽前体140.5 pg/mL，肌钙蛋白T 0.031 ng/mL；床旁血气提示酸碱度6.918，血清葡萄糖26 mmol/L，乳酸10.0 mmol/L，钾2.7 mmol/L为危急值；血氨138.7 μmol/L。支气管镜检查发现气管及各级支气管壁均有大量淡黄色斑块状物质附着，给予充分灌洗，附着物脱落，各级支气管均灌洗出浑浊淡黄色液体。床旁胸片可见两肺大片影，左肺透光度减低。入院第2天，复查胸片可见右上肺片状影较前显著，细菌毒素动态定量124.5 pg/mL，肌酸激酶同工酶61.830 ng/mL，B型钠尿肽前体20 443.000 pg/mL，肌钙蛋白T 0.063 ng/mL，明显升高，考虑与溺粪引起感染和窒息相关。

1.2仪器与试剂 哥伦比亚血琼脂平板、巧克力色血琼脂平板(郑州安图生物工程股份有限公司)，全自动血培养仪及血培养瓶(美国BD公司)，MALDI Biotyper 微生物快速鉴定仪及靶板、基质液和甲酸(德国布鲁克公司)。

1.3方法

1.3.1细菌分离鉴定 该患者入院后24 h内进行双侧血培养检查。临床上严格按照血培养操作流程进行血培养标本采集，运用BD公司BACTEC Plus Aerobic/F血培养瓶机器进行检测。血培养机器连续培养33 h 40 min后报阳。

1.3.2细菌的分离培养与革兰染色镜检 将血培养瓶菌悬液离心后接种于哥伦比亚血琼脂平板及巧克力血琼脂平板，放置37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，哥伦比亚血琼脂平板和巧克力血琼脂平板上均见细小突起，光滑湿润，边缘整齐的圆形菌落，挑取单个菌落革兰染色镜检。

1.3.3基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测 以乙腈∶纯水∶三氟乙酸(TFA)为50∶47.5∶2.5比例配制标准溶剂；取Bruker HCCA粉末(每管2.5 mg)添加250 μL标准溶剂充分溶解备用。使用接种环取哥伦比亚血琼脂平板上培养的单个菌落，加1 mL 70%乙醇振荡灭活，离心去上清液，再向沉淀中加入70%甲酸50 μL及乙腈50 μL，振荡离心取上清液待测。取 1 μL上清液滴于靶板上晾干，再加上1 μL基质溶液，晾干后上机检测。

2 结 果

2.1细菌培养 哥伦比亚血琼脂平板上培养24 h后出现细小突起，光滑湿润，边缘整齐的单个圆形菌落，见图1。细菌革兰染色阴性，见图2，呈轻微弯曲，无芽孢特征，尿素酶试验阴性，氧化酶、触酶试验阳性。

图1 哥伦比亚血平板35 ℃培养24 h

图2 革兰染色镜检(油镜，×1 000)

2.2细菌鉴定 MALDI-TOF-MS鉴定结果显示该分离株与已知菌库中嗜低温弓形菌一致，分值为1.907，见图3。

图3 质谱菌落鉴定图谱

2.3治疗经过 患儿入院后，监测生命体征，给予机械通气，心肺复苏及抢救药物应用，维持内环境稳定、抗感染、止血等综合治疗。入院第3天患儿突然出现心率下降至60次/分，予心肺复苏、抢救药物应用，后心跳为0次/分，血压测不出，SPO2测不出，抢救后患儿自主心率无恢复，家属要求自动出院。

3 讨 论

与人类感染有关的弓形菌属主要有嗜低温弓形菌(群)和布氏弓形菌，这两种菌主要引起急性肠胃炎，布氏弓形菌还可引起肠外感染，包括菌血症、细菌性心内膜炎、腹膜炎等[4]。嗜低温弓形菌为微需氧细菌，适宜生长在中性或偏碱性环境中，主要存在于污水中，有潜在危害，人体接触后可危害身体健康[5]。该患儿入院检查显示白细胞计数增高，细菌毒素动态定量检测明显升高，两肺纹理粗，两肺可见大片影及斑片影等炎症体征，提示细菌感染，可引起菌血症，入院及时进行血培养检测。传统的细菌鉴定有一系列的流程和方法，耗时长，程序烦琐，通常还需要检测者具有一定的经验。MALDI-TOF-MS是近几年发展起来的一种新型有机质谱技术，是利用蛋白质谱学的全新微生物快速检测和鉴定技术，鉴定方法快速、准确、可靠。目前国内运用MALDI-TOF-MS鉴定和检测微生物已经取得了很好的进展，尤其是在细菌的种属鉴定方面，已经可以很好地将菌株鉴定到种的水平。

近年来研究发现，嗜低温弓形菌是一种潜在的食源性和水源性病原体，可通过食品处理过程的交叉污染、食用受污染的动物源食品、受污染的饮用水或直接被粪便污染而发生感染[6-7]。BRÜCKNER等[8]研究显示，嗜低温弓形菌和布氏弓形菌是引起人类胃肠炎的新型病原体，并利用肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链反应(EICR-PCR)进行毒力基因测定，显示嗜低温弓形菌在体外有显著的细胞毒作用。国外的调查显示，嗜低温弓形菌在鸡肉中的流行率明显高于猪肉和牛肉[9]。BARBOZA等[6]报道1例27岁的哥斯达黎加女性，因食用鸡肉而罹患腹泻，并从其血性水样便中分离培养出嗜低温弓形菌。PUIG等[10]报道1例西班牙儿童因食品污染导致嗜低温弓形菌肠道感染，患儿应用四环素类抗菌药物治疗完全恢复正常。BRÜCKNER等[11]报道在德国门诊和住院患者粪便样本中，弓形杆菌属主要分离鉴定出布氏弓形菌和嗜低温弓形菌，对布氏弓形菌感染，环丙沙星可能作为首选药物。本例患儿有溺粪病史，嗜低温弓形菌存在于污水中，接触污水是一种潜在的感染方式[6,12]，患儿可能出现血流感染。弓形菌属在代谢上呈惰性，生长缓慢，很难通过生化测试来鉴定，因此对不同种的区分更多依靠分子生物学方法[1,6]。本研究采用MALDI-TOF MS对菌株进行分离鉴定，鉴定结果显示该分离株与已知菌库中嗜低温弓形菌一致，分值为1.907，鉴定为嗜低温弓形菌。由于缺乏针对弓形菌耐药性的检测标准，造成目前对于弓形菌耐药性的真实判断难度较大[7]。王晨希[13]研究显示嗜低温弓形菌对常见的氨苄青霉、头孢菌素类表现出较强的耐药性。VAN DEN ABEELE 等[14]报道在梯度扩散法中观察到嗜低温弓形菌对氟喹诺酮类药物较高耐药性。FERA等[15]报道体外试验中亚胺培南是最有效的β-内酰胺类药物，头孢菌素中头孢吡肟表现出较高抗菌活性，而青霉素、氯霉素、万古霉素具有高水平耐药性。本研究因患儿放弃治疗未能进行相关药敏试验。

目前来自不同国家关于弓形菌属引起感染的报道越来越多，但仍然没有直接与这种病原体的感染和发病相关的毒力因子报道[16-17]。我国嗜低温弓形菌人体感染的相关报道较少，对于嗜低温弓形菌的抗感染治疗尚无经验可借鉴。本患儿因溺粪昏迷，患儿在粪池中窒息，嗜低温弓形菌可经过呼吸道进入患者体内导致菌血症，引发人体感染。临床医师对于有溺水、溺粪经历的患者，应该警惕该细菌感染可能。