弥漫大B细胞淋巴瘤中SENEX基因与Rb/E2F1通路的相关性及临床病理意义

孔 锦，胡东玉，孙 谦，冯 蕾

济宁医学院附属医院：1.肿瘤科；2.静脉用药调配中心；3.药剂科，山东济宁 272000

弥漫大 B 细胞淋巴瘤(DLBCL)是最常见的B细胞性非霍奇金淋巴瘤(NHL)，具有较强的异质性和侵袭性。近年来DLBCL的治疗取得了较大进步，由环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松组成的标准化疗及利妥昔单抗靶向治疗等方案使DLBCL的治疗效果明显改进，尽管如此，仍有30%～40%的患者复发并最终死亡[1-2]。因DLBCL的异质性，其发病机制尚未完全阐明，临床上也缺乏评估病情及预后的分子标志物。SENEX基因是新发现的一类促癌基因，DLBCL相关的细胞实验证实，沉默SENEX基因能够抑制DLBCL细胞中Rb/E2F1通路介导的增殖效应[3]。基于此，本研究将以DLBCL患者为对象，分析SENEX基因表达与Rb/E2F1通路及预后的关系，旨在为阐明SENEX在DLBCL发病中的作用及机制积累临床研究数据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年1月至2019年12月本院收治的84例DLBCL患者作为DLBCL组，纳入标准：(1)经病理学确诊DLBCL[4]；(2)首次确诊；(3)临床病理资料完整；(4)临床样本按要求保存。排除标准：(1)接受过放化疗；(2)既往有其他恶性肿瘤、自身免疫性疾病病史。参照王静等[5]的研究，选择在本院诊断为淋巴结反应性增生的40例患者作为对照组。DLBCL组中男44例、女40例，年龄16～85岁、平均(59.44±11.32)岁；对照组中男22例、女18例，年龄23～75岁、平均(57.23±10.06)岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得医院伦理委员会批准、取得患者知情同意。

1.2SENEX、pRb、E2F1表达水平的检测 取DLBCL组的肿瘤组织及对照组的淋巴结组织适量，加入组织裂解液并匀浆，得到的匀浆液在离心机中按照条件4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液进行Western blot检测：首先在聚丙烯酰胺凝胶内电泳分离不同相对分子质量的蛋白，而后电转移至硝酸纤维素膜，将膜放入5%脱脂牛奶中室温孵育1 h，洗膜后放入SENEX一抗(美国Abcam公司，1∶1 000稀释)、pRb一抗(美国CST公司，1∶1 000稀释)、E2F1一抗(美国Abcam公司，1∶1 000稀释)或β-actin一抗(美国Abcam公司，1∶5 000稀释)中、4 ℃孵育，洗膜后放入1∶2 000稀释的二抗中室温孵育1 h，在凝胶分析系统(上海天能公司)中显影得到蛋白条带，根据条带的灰度值、以β-actin为内参对SENEX、pRb、E2F1的蛋白表达水平进行定量分析。

1.3DLBCL患者临床病理特征的记录 查阅DLBCL患者的病历资料，记录以下临床病理特征：年龄、性别、肿瘤最大径、B症状、国际预后指数(IPI)、GCB亚型、Ann Arbor分期。

1.4DLBCL预后的随访 采用门诊复诊、电话或网络回访的方式对DLBCL的预后进行随访，随访终点为死亡，随访截止时间为2021年3月31日。

2 结 果

2.1DLBCL组与对照组SENEX、pRb、E2F1表达水平的比较 与对照组比较，DLBCL组患者肿瘤组织中SENEX、pRb、E2F1表达水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

图1 DLBCL组与对照组SENEX、pRb、E2F1表达的Western blot检测结果

表1 DLBCL组与对照组SENEX、pRb、E2F1表达水平的比较

2.2DLBCL组中不同临床病理特征患者SENEX、pRb、E2F1表达水平的比较 DLBCL组中不同年龄、性别、GCB亚型的患者，肿瘤组织中SENEX、pRb、E2F1表达水平的比较，差异无统计学意义(P>0.05)；肿瘤最大径≥5 cm、有B症状、IPI为3～5、Ann Arbor分级为Ⅲ～Ⅳ级的患者肿瘤组织中SENEX、pRb、E2F1表达水平均高于肿瘤最大径<5 cm、无B症状、IPI为0～2、Ann Arbor分级为Ⅰ～Ⅱ级的患者(P<0.05)。见表2。

表2 DLBCL组中不同临床病理特征患者SENEX、pRb、E2F1表达水平的比较

续表2 DLBCL组中不同临床病理特征患者SENEX、pRb、E2F1表达水平的比较

2.3DLBCL组SENEX、pRb、E2F1表达水平的相关性 DLBCL组患者肿瘤组织中SENEX的表达水平与pRb、E2F1的表达水平呈正相关(r=0.553、0.236，P<0.05)；pRb的表达水平与E2F1的表达水平也呈正相关(r=0.442，P<0.05)。见图2。

注：A为SENEX表达水平与pRb表达水平的相关性分析；B为SENEX表达水平与E2F1表达水平的相关性分析；C为pRb表达水平与E2F1表达水平的相关性分析。图2 DLBCL组SENEX、pRb、E2F1表达水平的相关性

2.4DLBCL组中不同SENEX、pRb、E2F1表达水平患者预后的比较 DLBCL组中不同SENEX、pRb、E2F1表达水平患者累积生存率的K-M曲线见图3，经Log-rank检验，SENEX、pRb、E2F1表达水平≥中位数患者的累积生存率均低于SENEX、pRb、E2F1表达水平<中位数的患者(P<0.05)。

注：A为SENEX不同表达水平患者的累积生存率；B为pRb不同表达水平患者的累积生存率；C为E2F1不同表达水平患者的累积生存率。图3 DLBCL组中不同SENEX、pRb、E2F1表达水平患者预后的比较

3 讨 论

DLBCL被认为是一种侵袭性淋巴瘤，具有较强的异质性，形态学及免疫分型复杂且发病的分子机制未完全阐明。目前，治疗DLBCL的方案包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松化疗及利妥昔单抗靶向治疗，但部分患者容易出现耐药、预后不佳，相关的流行病学资料显示DLBCL的5年生存率为30%～40%[6-7]。因此，研究DLBCL的发病机制、发现DLBCL发病过程中起关键作用的基因，不仅有助于发现疾病早期诊断、病情评估的分子标志物，也有助于发现新的治疗靶点。

近年来，越来越多的基础研究发现了不同基因表达异常与DLBCL的发病有关[5,8]，完颜智翔等[3]通过细胞实验证实SENEX基因参与DLBCL细胞增殖的调控，敲低SENEX基因显著抑制DLBCL细胞增殖。SENEX是参与细胞生长、衰老、增殖、凋亡调控的新型基因，LOVELACE等[9]在内皮细胞中证实，SENEX定位于微管、通过维持微管稳定性的方式促进内皮细胞生长。另有两项细胞实验均证实SENEX参与DLBCL细胞增殖的调控[10-11]。本研究在上述细胞实验中SENEX基因促增殖的基础上以DLBCL患者为对象，分析了SENEX基因在DLBCL发病中的作用，结果显示，与对照组比较，DLBCL组织中SENEX的表达水平明显升高并且随着肿瘤最大径、IPI、Ann Arbor分级增加及B症状的出现，SENEX的表达水平呈升高的趋势，表明SENEX表达增加与DLBCL的发病及病理进展有关，其可能机制是高表达的SENEX促进了肿瘤细胞的增殖。

根据完颜智翔等[3]的细胞实验结果，SENEX促进DLBCL细胞增殖的分子机制是激活下游Rb/E2F1通路。Rb/E2F1是经典的细胞周期调控通路，Rb通过磷酸化和去磷酸化的方式调控下游E2F1的激活，去磷酸化的Rb与E2F1结合并阻碍E2F1发挥生物学作用，Rb磷酸化为pRb后与E2F1解离，E2F1通过激活细胞周期蛋白的方式促进细胞生长[12-13]。为了进一步验证SENEX在DCBCL发病中的作用，本研究对SENEX下游Rb/E2F1通路进行了分析，结果发现DCBCL中Rb/E2F1通路的表达与SENEX表达的变化一致，即DLBCL组织中pRb、E2F1的表达增加且与病理进展有关；相关性分析证实，SENEX的表达与pRb、E2F1的表达呈正相关(P<0.05)。以上结果表明SENEX下游Rb/E2F1通路的激活与DCBCL的发病及病理进展有关，高表达的SENEX可能在DLBCL的发病中通过激活Rb/E2F1通路发挥促进细胞增殖的作用。

DLBCL患者的预后不佳，目前的临床研究认为IPI、Ann Arbor分级等病理特征是DLBCL患者预后的独立影响因素[14-16]。本研究已经在DLBCL中证实SENEX基因及其下游Rb/E2F1通路与疾病进展有关，在此基础上进一步分析其与DLBCL患者预后的关系，随访DLBCL患者的生存情况并通过K-M曲线比较累积生存率的差异可知，DLBCL中SENEX、pRb、E2F1表达增加与累积生存率降低有关，由此表明SENEX及其下游Rb/E2F1通路不仅与DLBCL的发病及病理进展有关，还与疾病的预后有关。

综上所述，DLBCL中SENEX基因表达增加与疾病进展及预后不良有关，激活下游Rb/E2F1通路是SENEX发挥作用的可能分子机制。SENEX有望成为发现DLBCL评估标志物、治疗靶点的新基因，而且有必要以SENEX基因为切入点研究DLBCL发病的分子机制。