2018-2019年石家庄市弓形杆菌致病基因的分布及其特征分析

剧慧栋，裴艳涛，赵田湉，赵 晨，蒋瑞萍

弓形杆菌(Arcobacter)是弓形杆菌属的统称，属于ε-变形菌纲弯曲杆菌科，该属目前已发现25种，其中嗜低温弓形杆菌(Arcobactercryaerophilus)、斯氏弓形杆菌(Arcobacterskirrowii)、布氏弓形杆菌(Arcobacterbutzleri)可以导致人类败血症、腹泻和动物流产、胃肠功能紊乱等疾病[1]，是一种潜在的人兽共患食源性病原体。2002年，食品微生物国际委员会将布氏弓形菌列入严重影响人类健康的病原[2]。引起弓形杆菌感染的主要途径是人类摄入受污染的动物源性食品、水及其他食品，携带弓形杆菌的狗、猫也可以感染人类[3]。国外对该菌的毒力基因有一定的研究，国内在该领域研究很少。本研究对石家庄地区采自市售食品中的71株弓形杆菌的9种毒力基因扩增检测，以便了解石家庄地区弓形杆菌种毒力基因的分布情况。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2018-2019年在石家庄市每个县、区各选择1～2个超市和农贸市场进行样品采集，每个采样地点采集禽肉、畜肉、熟食、水产品、环境等各类样品10份，从采集的生鲜鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉、罗非鱼、鲤鱼、蛏子、螃蟹、鱼丸、蟠桃、集贸市场操作桌面，共分离布氏弓形杆菌66株，嗜低温弓形杆菌5株，弓形杆菌的检出率为19.72%，见表1。

表1 71株弓形杆菌菌株来源 Tab.1 Arcobacter strains used in the study

1.2 试剂与仪器 PCR仪(美国Bio-Rad)，毛细管电泳系统(德国Qiagen)，生物安全柜(美国Thermo)，三气培养箱(德国Binder)，振荡器(其林贝尔公司)，微生物质谱检测系统(德国Bruker)。

弓形杆菌检测试剂盒、哥伦比亚血平板均购自青岛中创生物科技有限公司，TaqTM购自宝生物工程有限公司，QIAxcel DNA Screening Kit和DNA Marker购自德国Qiagen公司，引物合成和测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.3 试验方法1.3.1 菌株的分离鉴定

1.3.1 菌株的培养 所有菌株在哥伦比亚血平板上划线，于37 ℃微需氧环境(5% O2、10% CO2和85% N2)中倒置培养48 h；用一次性无菌接种针纯培养后的单菌落均匀涂抹在MALDI 靶板的样本孔位中，自然晾干；在干燥后的标准品或样本上加1 μL基质溶液，自然晾干；放入Bruker微生物质谱检测系统进行菌株鉴定[4]。

1.3.2 引物设计 9种目的基因的引物由上海生工生物技术有限公司公司合成。引物序列及扩增片段长度[5]，见表2。

表2 引物序列及其扩增片段大小Tab.2 Primers for amplifications of ciaB, cj1349, pldA, irgA, hecA, tlyA, mviN, hecB genes

1.3.3 DNA模板制备 弓形杆菌DNA模板制备可采用水煮法进行。取一环新鲜培养的弓形杆菌分离株培养物(10 μL)，加入200 μL无菌生理盐水中，振荡混匀，13 000 r/min离心2 min，弃去上清液；加入100 μL超纯水，振荡混匀，在沸水中煮10 min，立刻放在冰上冷却，13 000 r/min离心2 min，吸取上清，-20 ℃保存，备用[6]。

1.3.4 PCR扩增 PCR反应的总体系为50 μL，具体如下：2 μL DNA模板，0.3 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL), 4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，5 μL正反向引物(10 μmol/L) ，5 μL 10×Taq Buffer(Mg2+Free)，3 μL MgCl2(25 mmol/L)，其余用水补足。扩增程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 5 min。

1.3.5 PCR产物分析 PCR产物电泳采用Qiaxcel毛细管电泳仪进行分析[4]。

2 结 果

2.1 致病基因在弓形杆菌中的分布 见表3。

表3 致病基因在弓形杆菌中的分布Tab.3 Distribution of pathogenic genes in Arcobacter cryaerophilus and Arcobacter butzleri

2.2 单种菌携带致病基因数量 见表4。

表4 单种菌携带致病基因数量统计Tab.4 Number of pathogenic genes associated with 71 Arcobacter strains

2.3 不同来源菌株中致病基因分布情况 见表5。

表5 不同来源菌株中致病基因分布统计Tab.5 Distribution of pathogenic genes in strains from different sources

3 讨 论

弓形杆菌严重威胁人类健康。本研究共采集71株弓形杆菌菌株，其中66株布氏弓形杆菌，5株嗜低温弓形杆菌。通过对布氏弓形杆菌和嗜低温弓形杆菌所携带的cadF(纤连蛋白)、ciaB(侵袭性抗原)、cj1349(纤连蛋白)、pldA(磷脂酶A)、mviN(肽聚糖生物合成)、tlyA(溶血素)、hecB(溶血素活化蛋白)、hecA(涉及攻击、聚集和细胞死亡的丝状血凝素)和irgA(铁离子调控的外膜蛋白)[7]9种致病基因进行分析发现，本研究中布氏弓形杆菌ciaB、mviN、tlyA、pldA、cj1349和cadF基因携带率在70.42%和90.91%之间，irgA、hecA、hecB基因携带率为3.03%～9.09%，在巴西Maria等和波兰Zacharow等的研究中，ciaB、mviN、tlyA和pldA基因携带率达到90%以上，cj1349在巴西布氏弓形杆菌中携带率高达98.1%，波兰布氏弓形杆菌中携带率为71%，cadF基因在波兰布氏弓形杆菌中携带率为90%，在巴西布氏弓形杆菌中携带率为72.7%[3,6]，irgA、hecA、hecB基因在国外布氏弓形杆菌种携带率介为34%～53%，本研究中irgA、hecA、hecB基因在布氏弓形杆菌的携带率明显低于巴西和波兰该菌的携带率，ciaB、mviN、tlyA、pldA、cj1349和cadF的携带率与与巴西和波兰布氏弓形杆菌携带率稍低[8]。

本研究嗜低温弓形杆菌9个致病基因的携带率明显低于布氏弓形杆菌，5株嗜低温弓形杆菌携带ciaB、mviN、tlyA、pldA、cj1349和cadF基因，携带率分别是80%、80%、40%、40%、20%和60%，不携带irgA、hecA、hecB基因，在波兰Zacharow等人的研究中，2株嗜低温弓形杆菌中仅分布有ciaB基因[6]，捷克David等在13株嗜低温弓形杆菌中检测到ciaB、MviN、tlyA3种基因，携带率分别是92.3%、84.6%和15.4%[9]，与石家庄地区嗜低温弓形杆菌携带致病基因相比，国外嗜低温弓形杆菌致病基因的携带率较低，考虑到本次所采集到的嗜低温弓形杆菌数量较少，不能完全反应9种致病基因在嗜低温弓形杆菌的分布情况，因此需要在今后实验中采集更多嗜低温弓形杆菌以期得到更客观的数据。

研究发现在71株弓形杆菌中仅有3株布氏弓形杆菌未携带上述9种致病基因，而大多从食品和环境分离出来的布氏弓形杆菌和嗜低温弓形杆菌都含有2～8致病基因，70%以上的菌株中分布有至少5个致病基因，其中16株携带5个致病基因，30株携带6个致病基因,7株携带7个致病基因，1株携带8个致病基因，说明采自石家庄地区的弓形杆菌绝大多数都致病，而且很多致病菌因为携带多个致病基因造成其具有较强的毒力，因此需要加强对石家庄地区市售生鲜肉食、海鲜、环境中弓形杆菌的检测，对检测结果阳性的超市、集贸市场等销售场所进行有针对性的消毒以控制弓形杆菌的传播预防由此引发的食物中毒很有必要。

利益冲突：无

引用本文格式：剧慧栋，裴艳涛，赵田湉，等. 2018-2019年石家庄市弓形杆菌致病基因的分布及其特征分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(7)：643-648. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.082