蛋白酶抑制因子对大鼠帕金森病造模条件探讨

胡玉英韦晓芸宋 曦钟 洁刘永辉罗荣卿

(1.广西中医药大学第一附属医院,南宁 530022;2.广西中医药大学,南宁 530007)

帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)是一种缓慢进展的神经退行性疾病,病理变化集中表现为黑质致密部(compacta of the substantianigra,SNc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性,其导致黑质纹状体通路缺失和纹状体内DA 水平降低。 动物模型的建立为研究PD 的病因以及发病机制提供了新的思路,因此人们根据PD 的病理特点制作了不同的动物模型。关于遗传性和散发性疾病泛素-蛋白酶体系统的最新研究结果表明[1],蛋白酶抑制剂是诱导PD 的候选毒素。 其中蛋白酶抑制因子PSI(proteasome inhibitors I,PSI)诱导的动物模型非常接近地概括PD 的关键特征[2],可能对研究疾病的发病机制和神经保护治疗有价值。 本研究通过对模型大鼠行为学及TH、α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)表达的测定,以期构建一个可用数据评估的慢性PD 模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

30 只SPF 级SD 大鼠,鼠龄3~4 月,体重为250~280 g,雌鼠,购自长沙市天勤生物技术有限公司[SCXK(湘)2014-0011]。 饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料(由实验动物中心提供)及自由饮水,恒定湿度,室温(23±2)℃。 动物实验经广西中医药大学伦理委员会审查,符合实验动物伦理学要求(DW20201011-099),并按规定执行,实验环境为广西中医药大学动物实验中心屏障环境动物实验室[SYXK(桂)2019-0001]。 按照实验动物使用的3R 原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

PSI(Z-lle-Glu(OtBu)-Ala-Leu-al)(生产厂家:美国ApexBio 公司;批号A1900);浸蜡脱蜡透明液(批号:200801)、苏木精染液(批号:191202)、伊红染色液(批号:200901)(生产厂家:南昌雨露实验器材有限公司);anti-α-syn antibody(生产厂家:索莱宝;型号:K101295P)、anti-TH antibody(生产厂家wanleibio;型号:WL01820);HRP 标记山羊抗兔(生产厂家:Servicebio;型号:GB23303)、高效RIPA 组织/细胞裂解液(生产厂家:Solarbio;型号:R0010)、蛋白酶抑制剂混合液(100 ×PIC) (生产厂家:Solarbio;型号:P6730);PBS 缓冲液(生产厂家Servicebio;型号:G0002)。 R0010 型赛默飞世尔脱水机(英国赛默飞公司Excelsior AS);莱卡组织切片机(型号:2235)、莱卡组织摊片机(型号:HI1210)、莱卡组织烤片机(生产厂家:上海莱卡);低温离心机(生产厂家:Eppendorf 公;型号:5418R);多功能酶标仪(美国MD FilterMax F3);Mini Trans-Blot Cell蛋白转印模块(湿转)(Bio-Rad);凝胶成像系统(生产厂家:上海天能;型号:Tanon 5200);显微镜(生产厂家:Nikon;型号:E100)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与模型制备

随机分为对照组10 只,PSI 模型组A 组和模型组B 组各10 只。 参照McNaught 等[3]及刘雨清等[4]皮下注射PSI 制作PD 慢性大鼠模型溶解方法:取PSI 粉剂5 mg,加入100% DMSO 溶液875 μL快速搅拌溶解,最后加入蒸馏水375 μL,配制成PSI溶液(浓度为70%),以75 μL/100 g(3 mg/kg),150 μL/100 g(6 mg/kg)进行颈背部皮下注射。 PSI模型组A、模型组B 大鼠分别给予皮下注入PSI 3 mg/kg、6 mg/kg,对照组给予70% DMSO 3 mg/kg皮下注射,分别于每周一、三、五进行大鼠颈背部皮下注射,连续给药2 周,共给药6 次。

1.3.2 行为学实验

实验过程中注意观察大鼠的自主行为变化,包括有无活动迟缓、少食少动、震颤、尾巴僵直、嗅探及易激惹等异常行为。 行为学检测前对大鼠进行训练1 周,分别于注射前1 d 及注射后第14、21、28天进行记录。

(1)爬杆实验 以大鼠爬竿实验考察大鼠行为变化,参照Zhang 等[5]的爬杆实验。 用一直径为1 cm,长50 cm 的木杆,顶端固定有一直径2.5 cm的软木小球,木杆上缠上纱布防滑,倾斜45°放置,大鼠头向下放置在软木小球的顶部,使其沿杆自然爬下,观察大鼠在下行过程中的行为及时间,对其进行评分。 同时观察爬行过程的行为。 每只测5次,每次隔3 min。 评分标准:0 分,大鼠从杆上一次顺利下,爬杆时间<4.00 s;1 分,大鼠停顿数次后能爬下,爬杆时间为4.01~8.00 s;2 分,大鼠缓慢爬行伴轻微震颤,爬杆时间为8.01~12.00 s;3 分,大鼠掉落,频繁性震颤,四肢僵直或爬杆时间>12.00 s。

(2)悬挂实验 参照Tao 等[6]设计的爬杆实验进行改良,1 个直径为1.5 mm 的不锈钢棒,水平放置于两支架间,两支架底座距离为20 cm,高度为30 cm,在横杆上方1 cm 处添加玻璃盖,下方铺布料防摔伤。 被测大鼠倒置悬挂于不锈钢棒中点后放开大鼠。 评分标准:0 分,大鼠双后爪均可抓住不锈钢棒;1 分,仅有一只后爪可抓住不锈钢棒;2 分,大鼠跌落,双后爪均抓不住不锈钢棒。

1.3.3 组织样本及切片制备

行为学实验结束后,将实验大鼠麻醉后打开胸腔,并经心内快速推注生理盐水50 mL,每组选取5只大鼠黑质部分,放置-80℃冰箱保存备用,用于后续Western blot 检测。 剩余各组5 只大鼠在灌注完生理盐水后,再缓慢推注100 mL 4%多聚甲醛,打开颅骨取材,用4%多聚甲醛进行固定保护24 h,用于进行HE 染色检测及免疫组化检测。

1.3.4 组织病理学观察

脑组织经脱水,经石蜡包埋后进行切片,厚度为3 μm,捞片,65℃烤片过夜,进行常规HE 染色,光镜观察。

1.3.5 Western blot 检测大鼠黑质区TH、DA 能神经元、α-syn 的表达

黑质组织称取20~40 mg,做好标记,加入裂解液200~400 μL,用移液器吹打裂解,转至EP 管,可用匀浆机匀浆至无明显的粘稠状匀浆,-20℃保存,电泳分离,恒流转膜90 min,室温下于封闭液中孵育3 h。 将膜置于一抗稀释液中,4℃孵育12 h,用TBST 洗膜(3×15 min);加入相应1 ∶4000 比例稀释的二抗中,37℃孵育1 h,PBS 洗涤(3×5 min),ECL显色,应用凝胶成像系统进行分析。

1.3.6 免疫组化检测大鼠黑质区TH、DA 能神经元、α-syn 的阳性表达

石蜡切片,经乙醇梯度脱水,用EDTA(PH=9.0)抗原修复,冷却后PBS 洗涤(3×5 min);放入3%双氧水溶液,室温避光孵育25 min,PBS 洗涤(3×5 min);在组化圈内滴加3% BSA 均匀覆盖组织,室温封闭30 min;滴加一抗工作液,4℃过夜。 添入二抗工作液,室温孵育50 min;PBS 洗涤(3×5 min)。DAB 溶液显色,阳性显色为棕黄色,自来水终止反应。 在显微镜下观察结果,拍片。 图像分析软件采用Image J 1.8.0,每张切片拍摄不同视野3 个,最后计算TH 阳性细胞数目。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20. 0 统计软件,所有数据均采用平均数±标准差(xˉ±s)表示。 采集3 次测量数据并取平均值进行统计,用t检验对组间差异比较分析,P<0.05 为有统计学意义。 使用Image J 1.8.0 软件对TH 阳性细胞进行数目统计,总数进行分析。

2 结果

2.1 皮下注射PSI 导致大鼠出现PD 样症状

注射PSI 后第14、21、28 天,通过观察大鼠有无活动迟缓、震颤、抓握、嗅探等异常行为,评估大鼠行为学改变情况。结果显示:第14 天,PD 模型组两组大鼠于第2 周皮下注射后均出现间断性细小的震颤、竖毛、嗅探、弓背;第21 天,PD 模型组两组大鼠均出现程度各异的震颤,症状持续10~20 min 后逐渐轻但仍有反复发作,且有毛发变黄,活动减少,动作变慢等变化;第28 天,PD 模型组两组大鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作迟缓等症状,模型组B 大鼠部分出现肢体麻痹,颤抖并且无法站立,与模型组A组相比较,上述行为学症状明显加重;上述行为学于对照组未出现变化。

2.2 爬杆实验

首次注射PSI 前24 h(即实验前24 h)监测大鼠爬杆行为并作出评分,而后将模型A、B 组评分与对照组作对比,无明显统计学差异(P>0.05)。 注射PSI 第14、21、28 天观察模型组两组大鼠爬杆行为,其评分明显升高,与对照组相比,差异显著(P<0.05)。 实验第21、28 天模型组B 评分较模型组A显著升高,两组差异显著(P<0.05)。 见表1。

表1 各组爬杆实验评分比较(±s)Table 1 Pole test scores of each group were compared

表1 各组爬杆实验评分比较(±s)Table 1 Pole test scores of each group were compared

注:与对照组相比,∗P<0.05;与模型组A 相比,#P<0.05。Note. Compared with Control group,∗P<0.05. Compared with Model group A,#P<0.05.

组别Groups注射前Before the injection注射后第2 周2 weeks after injection注射后第3 周3 weeks after injection注射后第4 周4 weeks after injection对照组Control group模型组A Model group A模型组B Model group B 6.25±3.55 6.33±2.77 6.31±2.73 6.69±2.17 5.79±1.87 10.37±5.78∗15.76±7.13∗21.70±7.61∗#6.06±0.95 12.17±5.22∗21.80±8.05∗44.40±8.05∗#

2.3 悬挂实验

对照组大鼠悬挂实验评分相对稳定,PSI 模型组随着时间的延长,评分逐渐降低,第14~21 天缓慢降低,第28 天急剧降低(P<0.05),且模型组B 评分较模型组A 显著降低(P<0.05)。 见表2。

表2 各组悬挂实验评分比较(±s)Table 2 Traction test scores of each group were compared

表2 各组悬挂实验评分比较(±s)Table 2 Traction test scores of each group were compared

注:与对照组相比,∗P<0.05;与模型组A 相比,#P<0.05。Note. Compared with Control group,∗P<0.05. Compared with Model group A,#P<0.05.

组别Groups注射前Before the injection注射后第2 周2 weeks after injection注射后第3 周3 weeks after injection注射后第4 周4 weeks after injection对照组Control group模型组Model group A模型组Model group B 2.53±0.39 2.53±0.42 2.37±0.43 2.33±0.45 2.60±0.47 2.10±0.65∗1.93±0.63∗1.33±0.38∗#2.57±0.45 2.07±0.60∗1.37±0.55∗0.53±0.53∗#

2.4 HE 染色

显微镜下观察HE 染色切片,结果显示对照组大鼠SNc 神经元数量丰富,胞体较大,多为圆形、椭圆形,胞浆染色较淡,核仁清楚。 与对照组相比,模型组A 细胞形态有改变,部分神经元胞体深染,胶质细胞增生(胶质细胞的细胞形态为核小、深染,呈扁圆形或三角形),说明大鼠神经元损伤;模型组B模型组细胞变形,镜下观察核仁不明显,同时伴随有深染物增多,与模型组A 比较程度加重。 见图1。

图1 各组大鼠黑质区HE 染色Figure 1 HE staining in rat melanoregion of each groups

2.5 Western blot 法检测大鼠黑质区TH 和α-突触核蛋白表达

与对照组比较,模型组两组大鼠黑质区TH 表达减少及α-syn 表达增加(P<0.05),其中模型组B的TH 表达显著低于模型组A(P<0.05),模型组B的α-syn 表达增加高于模型组A(P<0.05)。 见图2。

2.6 免疫组化染色检测大鼠黑质区TH 和α-突触核蛋白阳性表达

免疫组化染色方法观察各组TH 阳性细胞数目的变化,研究结果表明:对照组TH 阳性细胞数目为(39.33±17.92)个、模型组A TH 阳性细胞数目为(22.00±2.65)个、模型组B TH 阳性细胞数目为(16.17±3.82)个、与对照组相比,模型组两组大鼠黑质区TH 表达显著降低(P<0.05),模型组B 低于模型组A(P<0.05),说明两组模型组大鼠TH 阳性神经元显著丢失。 见图3。

图3 脑黑质中TH 阳性表达Figure 3 TH positive expression in the substantia nigra

注:与对照组相比,∗P<0.05;与模型组A 相比,#P<0.05。图2 大鼠黑质区TH 和α-突触核蛋白比较Note. Compared with control group, ∗P<0.05. Compared with model group A, #P<0.05.Figure 2 Comparison of TH and α-syn in substantia nigra of mice

3 讨论

PD 动物模型制备方法多种多样,尚未有统一定论,各种动物模型都有各自的优点与不足[7]。 6-OHDA 模型不能模拟人类PD 的所有病理和临床特征,它在保存非DA 能神经元的情况下诱导DA 能神经元死亡,但不会形成胞浆内含物(路易小体)[8]。 6-OHDA 不影响与PD 有关的其他脑区,如前嗅觉结构、低位脑干区或蓝斑[9-10]。 MPTP 模型多为急性或亚急性模型,病理局限于黑质纹状体系统,该模型也显示TH 神经元丢失,但未见典型的路易小体[11-12]。 鱼藤酮诱导大鼠黑质神经细胞变性并形成包涵体,但这种化合物也引起更广泛的变性,涉及纹状体和小脑神经元,这种模式在PD 中并不典型[13]。 给小鼠使用除草剂百草枯以及联合使用百草枯和杀菌剂会导致黑质中多巴胺能神经元的丢失,但百草枯不会即刻越过血脑屏障[14]。 百草枯、鱼藤酮的模型会导致很高的死亡率,因为它们具有很高的全身毒性[15-16]。

研究表明PD 患者死后黑质组织中泛素-蛋白酶体途径存在结构和功能缺陷[17]。 这些基本发现激发了基于蛋白酶体抑制剂的新一代动物模型的发展,该模型利用蛋白酶体抑制剂来扰乱蛋白质稳态,产生进行性黑质DA 能细胞丢失、路易小体形成和行为障碍[18-19],由于该模型能够触发内源性蛋白(如突触核蛋白)的聚集,导致神经毒性,从而复制了PD 的中心致病途径之一,因此引起了研究界的关注。

蛋白酶体抑制剂诱导的PD 模型比以前描述的毒素引起的疾病模型有几个优点,McNaught 等[20]通过研究表明,该模型在治疗停止后数周缓慢进展,一旦启动,神经退化过程可能是自我维持的。其次,蛋白酶体抑制剂诱导的神经变性不限于黑质纹状体系统,还包括其他结构,如蓝斑、迷走神经背侧运动核和梅纳德氏基底核,这些结构也与PD 有关。 蛋白酶体抑制大鼠的SNc 神经元,且大鼠的蓝斑和迷走神经背侧运动核中形成了路易体样包涵体。 因此,蛋白酶体抑制剂诱导的PD 大鼠模型比其他模型更能概括人类PD 的疾病特征,我们也可以推测环境中类似的毒素可能会导致或促进易感人群的疾病发展。

本研究通过皮下注射PSI 的方式,作用于SD 大鼠诱导PD 动物模型。 已有研究证实,PD 运动症状的产生与相关基底神经节活动失调及黑质DA 能神经元丢失关系密切[21]。 相关病理结果证明聚集性α-syn 是PD 的重要标志,异常高表达的α-syn 能够引起PD[22]。 TH 是合成DA 的限速酶,在大脑黑质中含量较高,TH 表达的减少使得DA 合成受限是导致PD 的主要原因;因此,TH 是PD 发病机制的关键点。 例如,α-syn 不仅通过抑制TH 的Ser40 磷酸化来抑制TH,而且还通过刺激蛋白磷酸酶2A 活性来抑制TH,从而减少DA 合成并导致PD。 因此,对黑质内α-syn 以及TH 表达水平进行检测,可推出DA能神经元的数量及位置,据此可明确PSI 所诱导PD模型的严重程度[23]。

从本次实验看,随着注射完成后时间的延长,模型组两组大鼠爬竿时间逐渐延长,悬挂时间逐渐缩短,2 周后逐渐出现行动迟缓、下颌不自主震颤、竖毛、尾僵直等症状。 造模3 周后的大鼠协调运动能力降低更为明显,活动减少,动作变慢;造模4 周后模型组B 大鼠多出现的步履蹒跚、甚至握杆不能。 上述表现均表明:PSI 皮下注射可造成大鼠的PD 样症状,模型组大鼠肢体协调能力、肌力、动作灵敏度等运动功能较对照组均明显下降,与模型组A 比较,模型组B 下降显著,表明增大PSI 剂量后,爬杆实验评分也随之增高,悬挂实验评分缩短。 从HE 染色和Western blot 检测结果分析,给药4 周后,模型组A 较对照组病理学显示TH 表达明显降低、α-syn 的表达显著增加,成功建立了符合行为学及病理学特征的PD 大鼠模型,而注射6 mg/kg 的模型组B 大鼠状态低下,与对照组相比,病理结果显示TH 阳性细胞显著减少,α-syn 高表达(P<0.05),因此可以选择隔天皮下注射3 mg/kg,作为PD 慢性模型的一般标准。 这一研究结果与McNaught等[3]、刘雨清等[4]采用PSI(3 mg/kg)皮下注射,连续2 周造模的研究结果相似。 McNaught 等[3]以1.5、3.0、6.0 或12.0 mg/kg 的剂量给大鼠注射溶于70%乙醇的PSI,并在PD 分级量表上仅观察到1.5和3.0 mg/kg 剂量的PSI 显著的行为效应(恶化)。而关于皮下注射PSI 的剂量可引起进行性运动障碍和黑质DA 能细胞丢失,这是有争议的,因为其他人没有复制这些发现,Bové 等[24]在啮齿类动物全身应用PSI 3.0、6.0 mg/kg 均不能诱导产生任何行为或病理学改变。 Bukhatwa 等[25]从未能够达到McNaught 报道的效应程度,实验采取PSI 剂量为8、12 和16 mg/kg 皮下注射诱导PD 模型,与对照组相比,大鼠黑质中中TH 阳性细胞的数量减少,但随着PSI 剂量的增加,TH 阳性细胞的损失变得不那么明显,只有在8 mg/kg 时才有统计学意义,同时发现神经元的丢失随着PSI 剂量的增加而减少。

PSI 具有诱导大鼠产生PD 典型特征的作用,多项研究在重复McNaught 等[3]实验方法时也得到相同结果,但仍有部分实验室在严格按照McNaught等[3]实验方法进行实验时得到相反结果[24-25],为验证此方法的可靠性,本次实验重复了McNaught等[3,20]研究,结果发现,PSI 诱导的PD 模型大鼠在3 mg/kg 剂量组上造模是成功的,在此基础上,本研究增加了行为学实验爬杆实验以及悬挂实验,进行整合行为学评分与形态学表现关联分析,以形态学结果为判定标准,在证实PSI 具有诱导大鼠产生PD典型特征作用的同时进一步分析了PSI 诱导PD 动物模型导致的PD 症状的严重程度。 鉴于样本量限制,本次我们仅采用3、6 mg/kg 作为模型组,未来本课题组将扩大进行PSI 剂量对比实验研究,同时目前也缺乏关于PSI 的药代动力学曲线和剂量与效果之间关系的数据,后续有必要对PSI 进行全面的药代动力学分析,这将有助于确定为什么很难在实验室之间观察到PSI 的一致影响的一些原因。

综上所述,本研究发现在皮下注射PSI 诱导的大鼠PD 模型中,很好地概括了PD 的关键特征,同时黑质中细胞形态存在改变、TH 表达降低,α-syn过表达,且本次增加采用悬挂及爬杆实验作为大鼠行为学表现的统计和评价,将行为学和形态学数据相互印证,这对PD 的发病机制、病理学与神经递质变化的研究以及治疗方法和效果的改善可能产生积极的影响。