PDCD2 促进TRAIL 刺激下T 细胞及HIV 潜伏感染T 细胞的凋亡

余雯惠杨晨波丛喆薛婧

(北京协和医学院比较医学中心,中国医学科学院医学实验动物研究所,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室,北京 100021)

程序性细胞死亡蛋白(programmed cell death protein,PDCD)是一类与程序性细胞死亡相关的蛋白质分子,普遍存在于各种生物体内,是维持正常生长所必需的[1]。 其中程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)在艾滋病领域研究较广泛。 多项研究表明HIV-1 感染者体内T细胞上高表达PD-1 分子[2-4],大量PD-1 的表达能抑制HIV-1 感染者T 细胞的功能,使其功能衰竭,增殖能力降低,从而促进了疾病进展[5]。 目前PD-1还被认为可能是HIV-1 潜伏库的标志物[6-7],在HIV-1 潜伏库的建立和维持中起一定的作用,因此PD-1 也被认为是一个潜在的治疗靶点[8-9]。

除PD-1 以外,其他程序性细胞死亡蛋白在HIV-1 中的研究较少。 程序性细胞死亡蛋白2(programmed cell death protein 2,PDCD2)又称为RP8,该基因表达一种高度保守的真核蛋白[10-11],在人体的多种组织中都有表达。 PDCD2 目前被认为在促进细胞凋亡中发挥着重要的调节作用[12-14],也有研究发现其在调控细胞增殖[15]、抑制肿瘤细胞生长[13]以及维持胚胎干细胞发育[16-17]等多种细胞功能中有一定的作用。 本研究中,我们对PDCD2 能否调节T 细胞及HIV-1 潜伏感染T 细胞的凋亡水平进行了初步探索,以期为HIV-1 潜伏感染细胞的清除提供一个新的方向和实验基础。

1 材料和方法

1.1 细胞

人胚肾细胞系293T(中国医学科学院医学实验动物研究所本实验室保存);T 淋巴细胞株Jurkat(ATCC);HIV 潜伏感染T 细胞株ACH2(中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心马丽英研究员馈赠)。

1.2 主要试剂与仪器

Anti-PDCD2 antibody [ EPR7159 ] ( Cat.ab126614) 购自Abcam;PDCD2 Antibody(Cat.LSC169493) 购 自LSBio;β-Tubulin (D2N5G) Rabbit mAb(Cat.15115)购自Cell Signaling Technology;PEAnnexin V Apoptosis Detection Kit 1(Cat.559763)购自BD Pharmingen 公司; TRAIL/Apo2L Protein,Human(Cat.HY-P7306)购自MCE 公司;pWPXL、pMD2.G、psPAX2 慢病毒转染质粒(由Dr. Didier Trono 馈赠);转染试剂-VigoFect(Cat.T001)购自Vigorous 公司;聚乙烯感染/转染试剂(Cat. TR-1003)购自Sigma-Aldrich 公司;人/猴PDCD2 全长质粒购自金斯瑞生物科技公司;PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Cat. RR037A)、TB Green Premix EX TaqTM(Cat.RR820A)购自TaKaRa 公司;TaqManTMRNA-to-CTTM1-步法试剂盒(Cat. 4392938) 购自Applied Biosystems 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit(Cat.52906)购自QIAGEN 公司。 荧光定量PCR 仪7500 型购自ABI 公司;荧光倒置显微镜Nikon ECLIPSE Ti 购自Nikon 公司;化学发光成像仪ChemiDoc XRS+购自Bio-rad 公司;流式细胞仪BD Accuri C6 购自BD 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 慢病毒包装及感染Jurkat、ACH2 细胞

将慢病毒包装质粒pWPXL、pMD2.G、psPAX2以2 ∶1 ∶2的比例与VigoFect 溶液配置成转染工作液。 将该工作液逐滴加入293T 培养皿中,37℃、5%CO2孵箱中培养6~8 h 后更换新鲜培养基,再继续培养36 h。 收集的上清与新鲜的完全培养基1 ∶1混合后,用于感染Jurkat 及ACH2 细胞,12 h 后更换新鲜培养基,此步骤重复两次后收集细胞用于后续实验。 PDCD2(H)及PDCD2(RM)表示过表达人/猴PDCD2 的稳定细胞株。

1.3.2 RT-PCR 检测细胞内PDCD2 mRNA 的表达水平

收取2×106个细胞并提取其RNA。 根据NCBI上人和猴PDCD2 基因和GAPDH序列,利用软件DNAMAN 进行PDCD2 和GAPDH引物的设计。 引物序 列 为: PDCD2-F: 5’-ACCCTAGACTGGAGATT GGGACATA-3’;PDCD2-R:5’-CAACCTCAGGCATA ATCTCATCTTC-3’; GAPDH-F:5’-CTGTTCGAGAG TCAGCCGCA-3’;GAPDH-R:5’-AGGCGCCCAATAC GACCAAA-3’。 数据结果通过2-ΔΔCt法进行计算。

1.3.3 Western blot 检测细胞内PDCD2 蛋白表达情况

收集5×106个细胞,裂解后取上清液进行电泳、电转及封闭,4℃过夜孵育一抗(Anti-PDCD2),室温1 h 孵育二抗(β-Tubulin),使用ECL 法曝光,蛋白条带的相对密度通过ImageJ 软件进行分析[18]。 同样分析内参。

1.3.4 重组蛋白TRAIL 刺激Jurkat、ACH2 细胞

取生长旺盛的Jurkat 和ACH2 细胞5×105个,加入终浓度为0、25、50、100、150、300 ng/mL 的TRAIL,混匀后置于37℃,5% CO2孵箱中培养,24 h后取细胞进行凋亡检测,最终选择25 ng/mL 的TRAIL 蛋白浓度用于后续刺激实验。

1.3.5 细胞凋亡的检测

收集5×105个细胞,预冷的PBS 及1×Annexin V Binding Buffer 洗3 遍后,加入5 μL PE-Annexin V和5 μL 7-AAD,室温下避光孵育15 min,过滤后流式检测细胞凋亡情况[19]。 Annexin V 阳性率的总和表示细胞的凋亡率。

1.3.6 细胞上清病毒载量的检测

取细胞上清提取病毒RNA,使用实时荧光定量PCR 检测细胞上清病毒载量[20-21]。 探针序列:FAM-5 ’-AAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAA-3 ’-TAMRA; 引 物 序 列: HIV gag-F: 5 ’-GGTGCG AGAGCGTCAGTATTAAG-3’;HIV gag-R:5’-AGCTC CCTGCTTGCCCATA-3’。

1.4 统计学方法

通过FlowJo V10 对细胞凋亡流式的数据进行分析,各项数据的统计与作图选用GraphPad Prism8软件,平均数±标准差(±s)来表示实验结果,P<0.05 为界限值,表示组间数据有显著性差异。

2 结果

2.1 不同浓度TRAIL 对Jurkat 及ACH2 细胞凋亡的影响

Jurkat 细胞在没有TRAIL 刺激条件下,凋亡率为(1.29±0.53)%,随着TRAIL 浓度的增加,凋亡率也逐渐增高。 从25 ng/mL 的(38.86±4.83)%逐渐增加至300 ng/mL 时的(49.44±4.79)%(图1A)。ACH2 细胞在上述不同浓度的TRAIL 刺激下,凋亡率变化与Jurkat 细胞一致,分别为(1.83±0.25)%、(16.14 ± 0.69)%、 (16.36 ± 0.78)%、 (16.10 ±0.63)%、(16.09±1.57)%、(15.79±0.67)%(图1B)。 最终确定使用25 ng/mL 的TRAIL 用于后续实验。

注:A:不同浓度的TRAIL 刺激24 h 后,Jurkat 细胞凋亡水平的变化;B:不同浓度的TRAIL 刺激24 h 后,ACH2 细胞凋亡水平的变化。图1 不同浓度的TRAIL 诱导Jurkat 及ACH2 细胞凋亡情况Note. A,Apoptosis rate of Jurkat cells after 24 hours of TRAIL treatment with different concentrations. B,Apoptosis rate of ACH2 cells after 24 hours of TRAIL treatment with different concentrations.Figure 1 Apoptosis of Jurkat and ACH2 cells induced by TRAIL at different concentrations

2.2 过表达PDCD2 的Jurkat 细胞在TRAIL 刺激下凋亡增加

本研究将人PDCD2 和猴PDCD2 成功克隆到pWPXL 载体中,由于pWPXL 载体本身带有EGFP标签,pWPXL 空载体与病毒包装质粒产生的病毒成功感染Jurkat 细胞(Jurkat-mock)后,可见细胞内绿色荧光蛋白表达,其GFP 的阳性率达98.6%(图2A)。 在RNA 水平上,与Jurkat 组细胞相比,Jurkat-PDCD2(H) 组及Jurkat-PDCD2(RM) 组细胞内PDCD2 mRNA 表达量分别增加了4.67 倍和3.53倍(图2B)。 在蛋白水平上,PDCD2 相对表达量在Jurkat-PDCD2(H)为1.26±0.07,在Jurkat-PDCD2(RM) 中为1.12±0.39。 Jurkat-PDCD2(H) (P<0.001)与Jurkat-PDCD2(RM)相对表达量显著高于Jurkat 及Jurkat-mock,有统计学差异(P<0.05,图2C)。

在不含刺激剂的情况下,对照组凋亡率为(1.56±0.24)%,Jurkat-PDCD2(H)及Jurkat-PDCD2(RM)细胞凋亡率分别为(1.51±0.22)%、(1.61±0.10)%,3 组细胞间凋亡率无显著性差异(P>0.05)。 在TRAIL 的刺激下,对照组、Jurkat-PDCD2(H) 及Jurkat-PDCD2(RM) 细胞凋亡率分别为(21.59 ± 1.45)%、 (26.59 ± 0.57)%、 (28.08 ±1.51)%。 与对照组相比,Jurkat-PDCD2(H)组(P<0.05)及Jurkat-PDCD2(RM)组(P<0.01)凋亡率明显增加,有显著性差异(图2D)。

注:A:Jurkat-mock 细胞GFP 表达情况;B:荧光定量PCR 检测Jurkat、Jurkat-mock、Jurkat-PDCD2(H)、Jurkat-PDCD2(RM)细胞株内人/猴PDCD2 mRNA 的表达水平;C:Western blot 检测Jurkat、Jurkat-mock、Jurkat-PDCD2(H)、Jurkat-PDCD2(RM)细胞株内人/猴PDCD2 蛋白表达水平;D:对照组、Jurkat-PDCD2(H)及Jurkat-PDCD2(RM)在有无TRAIL 刺激下的凋亡水平。 与对照组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001。图2 Jurkat、Jurkat-mock、Jurkat-PDCD2(H)、Jurkat-PDCD2(RM)细胞株内PDCD2 的表达情况及细胞凋亡水平Note. A, Levels of GFP in Jurkat-mock cells. B,Levels of human /macaque PDCD2 mRNA in Jurkat,Jurkat-mock,Jurkat-PDCD2(H) and Jurkat-PDCD2(RM) cells were detected by qPCR. C, Expression levels of human/macaque PDCD2 protein in Jurkat, Jurkat-mock, Jurkat-PDCD2(H)and Jurkat-PDCD2(RM) cells were detected by Western blot. D, Apoptosis rate of Jurkat-PDCD2(H), Jurkat-PDCD2(RM) and the control cells with or without TRAIL treatment. Compared with the control group, ∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001.Figure 2 Expression levels of PDCD2 and apoptosis rate in Jurkat, Jurkat-mock, Jurkat-PDCD2(H) and Jurkat-PDCD2(RM) cells

2.3 过表达PDCD2 的ACH2 细胞在TRAIL 刺激下凋亡增加

本研究再次将克隆有人PDCD2 和猴PDCD2 的pWPXL 空载体与包装质粒产生的病毒成功感染ACH2 细胞(ACH2-mock),该细胞内表达有绿色荧光蛋白,其GFP 的阳性率为73.5%(图3A)。 在RNA 水平上,ACH2-PDCD2(H)组细胞及ACH2-PDCD2(RM)组细胞内PDCD2 mRNA 表达量分别比ACH2 组细胞多5.49 倍和4.02 倍(图3B)。 在蛋白水平上,ACH2-PDCD2(H) 及ACH2-PDCD2(RM)细胞PDCD2 相对表达量为0.68±0.19、0.63±0.16。 与ACH2 及ACH2-mock 细胞相比,ACH2-PDCD2(H)细胞(P<0.01)和ACH2-PDCD2(RM)细胞PDCD2 相对表达量显著升高,有统计学差异(P<0.01,图3C)。

在不含TRAIL 的情况下,对照组、ACH2-PDCD2(H) 及ACH2-PDCD2(RM) 细胞凋亡率分别为(1.22±0.27)%、(1.41±0.16)%、(1.47±0.25)%,3组细胞间的凋亡率无显著性差异(P>0.05);在TRAIL 的刺激下,对照组凋亡率为(11.5±0.93)%,ACH2-PDCD2(H)及ACH2-PDCD2(RM)细胞凋亡率为(15.87±1.39)%、(17.81±1.40)%。 与对照组相比,ACH2-PDCD2(H)组(P<0.01)、ACH2-PDCD2(RM)组凋亡率显著高于对照组,有统计学差异(P<0.01,图3D)。 TRAIL 刺激下,ACH2-PDCD2(H)组(P<0.01)与ACH2-PDCD2(RM)组细胞上清HIV病毒载量明显高于ACH2 组,有统计学差异(P<0.05,图3E)。

注:A:ACH2-mock 细胞GFP 表达情况;B:荧光定量PCR 检测ACH2、ACH2-mock、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)细胞内人/猴PDCD2 mRNA 的表达水平;C:Western blot 检测ACH2、ACH2-mock、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)细胞内人/猴PDCD2 蛋白表达水平;D:ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)及对照组在未刺激及TRAIL 刺激下的凋亡水平;E:荧光定量PCR 检测未刺激及TRAIL 刺激下ACH2、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)细胞上清HIV 病毒载量。 与对照组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001。图3 ACH2、ACH2-mock、ACH2-PDCD2(H)、ACH2-PDCD2(RM)细胞内PDCD2 的表达情况及细胞凋亡水平Note. A, GFP expression in ACH2-mock cells. B, Expression levels of human/macaque PDCD2 mRNA in ACH2, ACH2-mock, ACH2-PDCD2(H)and ACH2-PDCD2(RM) cells were detected by qPCR. C, Expression levels of human/macaque PDCD2 protein in ACH2, ACH2-mock, ACH2-PDCD2(H) and ACH2-PDCD2(RM) cells were detected by Western blot. D, Apoptosis rate of ACH2-PDCD2(H), ACH2-PDCD2(RM) and the control cells with or without TRAIL treatment. E, RT-PCR was used to detect viral load in the supernatant of ACH2, ACH2-PDCD2(H) and ACH2-PDCD2(RM) cells stimulated by TRAIL. Compared with the control group, ∗P< 0.05, ∗∗P< 0.01, ∗∗∗P< 0.001.Figure 3 Expression levels of PDCD2 and apoptosis rate in ACH2, ACH2-mock, ACH2-PDCD2(H) and ACH2-PDCD2(RM) cells

3 讨论

据目前文献报道,PDCD2 在调节细胞凋亡中起重要作用,有研究者认为PDCD2 可以通过激活caspase 通路来促进人髓系白血病细胞的凋亡[12],也有研究者发现PDCD2 可通过p53 途径诱导胃癌细胞的凋亡[22]。 本研究中我们发现,在不含刺激剂的情况下,PDCD2 的表达水平不能影响T 细胞的凋亡,但在TRAIL 介导下,PDCD2 的高表达可以有效调节T 细胞的凋亡,说明PDCD2 需要在一定的刺激条件下才能充分发挥其促进T 细胞凋亡的功能。T 细胞是人体重要的免疫细胞,CD4+T 细胞则是艾滋病病毒难以根除的重要潜伏库细胞之一。 为了探讨PDCD2 在HIV-1 潜伏感染T 细胞中的作用,我们利用ACH2 细胞株,构建了稳定转染PDCD2 的HIV-1 潜伏感染T 细胞株,证实了PDCD2 可以促进TRAIL 刺激下HIV-1 潜伏感染细胞的凋亡以及HIV病毒的释放,提示PDCD2 在诱导HIV-1 潜伏感染细胞的凋亡及HIV 病毒活化的过程中扮演重要角色。对PDCD2 促进TRAIL 诱导细胞凋亡的作用通路及其调控分子进行深入研究,有助于了解HIV-1 潜伏感染细胞凋亡的作用机制,为寻找清除病毒潜伏库的方法和策略提供理论依据。

人和恒河猴的PDCD2 在CDS 序列上有21 个碱基的差异,共引起12 个氨基酸的改变。 本研究还比较了人和猴这两种生物PDCD2 在T 细胞株中的表达和诱导凋亡情况。 本研究中分别构建了人PDCD2-Jurkat/ACH2 和 猴PDCD2-Jurkat/ACH2 稳定细胞株,qPCR 和Western blot 结果显示人和猴PDCD2 的表达量基本相同,在人和猴PDCD2 表达量基本一致的情况下,它们的表达增高均可以促进TRAIL 刺激下T 细胞的凋亡,且两者介导的凋亡无显著差异。 这些结果说明,尽管人和猴的PDCD2 在氨基酸序列上存在一定差异,但这些差异不影响PDCD2 的表达和其介导的T 细胞凋亡。 综上,人和猴PDCD2 对T 细胞及HIV-1 潜伏感染T 细胞的凋亡均具有促进作用。