复合绿茶对高脂血症小鼠有机酸代谢的影响

2022-06-23梅鑫宋玉颜田维素郭菥蓥木仁杨再波周才碧

食品研究与开发 2022年11期

梅鑫，宋玉颜，田维素，2，郭菥蓥，2，木仁，杨再波，周才碧*

（1.黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州都匀 558000；2.福建农林大学园艺学院，福建福州 350000；3.黔南民族师范学院化学与化工学院，贵州都匀 558000）

随着人们生活水平的提高，不良的生活方式和不均衡的膳食结构导致高脂血症并引发脂肪肝、糖尿病、冠心病等多种疾病[1]。高脂血症是指由于饮食习惯、生活环境以及个人身体素质等因素导致血浆中低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglycerides，TG）和总胆固醇（total cholesterol，TC）发生异常的一种全身脂代谢紊乱疾病[2-3]。目前，研究者已针对高脂血症研发出多种治疗方法和化学合成药物，他汀类药物作为临床调脂药的首选，长期使用存在诱发肝肾损伤的风险，其作用机制可能与其改变体内胆汁酸代谢而引起胆汁酸淤积有关[4]。

茶具有减肥、消炎、杀菌、抗癌等作用[5]。相关研究表明茶叶可通过改变细胞的氧化还原状态来调节编码肝脏中糖生成酶及蛋白质酪氨酸磷酸化酶的基因，抑制大鼠肝癌H4IIE细胞降低肝损伤的严重程度[6-10]。摄入速溶普洱红茶能够有效降低小鼠血脂中的丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性[11]。连翘叶茶可提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，减少小鼠肝脏中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，增强抗氧化能力，减少自由基的产生，缓解细胞因子导致肝细胞损伤进而对肝脏起到保护作用[12]。苦丁茶作为一种药用植物，其降糖、降脂活性成分已被用于药理研究。研究表明，苦丁茶可调节小鼠因摄入高脂饲料而导致的糖脂代谢紊乱，其机理可能与苦丁茶中的某些有效成分能促进肝脏中羟甲基戊二酰辅酶A（hydroxymethylglutaryl coenzyme A，HMGCoA）还原酶基因表达有关，从而抑制脂肪酸合成酶活性，诱导肝脏中TC的合成与摄取，增加胆汁酸的排泄[11-13]。复合茶可以降低因高脂饮食诱导的小鼠肝脏和代谢紊乱，减少肝脏脂肪变性，具有抗糖尿病、抗炎和抗氧化作用，防止肝脏脂肪堆积[14]。因此茶作为一种天然、安全的植物资源，深入开发其降脂活性成分具有非常重要的现实意义和广阔的应用前景。

代谢组学是对相关代谢物质代谢产物分析的一门技术，主要观察生物体因遗传修饰和生理或病理刺激而引起的差异代谢物的变化过程[15]。代谢组学是一种整体生物体系分析手段，可通过代谢图谱直接判别机体生理与生化状态，是对基因组学和其他组学的重要补充，现已广泛应用于医学、毒理学、食品营养科学等领域[16-17]。本文利用代谢组学技术，研究复合茶对高脂血症小鼠肝脏代谢的影响，旨在探索复合茶的降脂机理，为该复合茶的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

都匀古树绿茶：贵州碧竖科技服务有限公司；都匀原树甜茶、都匀阔叶苦丁、荷叶、野薄荷、金银花：市售。本实验采用都匀古树绿茶、都匀原树甜茶、都匀阔叶苦丁、荷叶、野薄荷、金银花拼配而成的复合茶。

甲醇、乙醇、乙腈（均为色谱纯）：美国Thermo Fisher Scientific公司。

实验动物：SPF 级雄性 KM 小鼠，体重（30±2）g，约5周龄（许可证号：430726210100155263），上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 仪器与设备

CTO-20AC柱温箱、IT-TOF质谱仪、CBM-20A系统控制器、DGU-20A5R在线脱气机、SIL-30AC自动进样器、LC-30AD液相输液泵：日本岛津公司；GenPure UV-TOC/UF xCAD超纯水器、Forma700超低温冰箱：美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 茶样制备

取适量复合茶样品将其粉碎，按1∶10（g/mL）的茶水比于100℃沸水中浸提30 min，真空抽滤后茶渣按同样的方法再浸提一次，合并两次提取液。将滤液旋转蒸发至适当浓度，于-80℃预冷12 h后真空干燥30 h，收集干粉，贮存于超低温冰箱中。

1.4 动物实验

适应性喂养7 d的健康雄性KM小鼠，随机分成为高脂模型组（NK）、复合茶低浓度组（DL）、复合茶高浓度组（DH）3组，每组10只。3组小鼠均饲喂高脂饲料，NK组灌胃饮用水，复合茶高（840 mg/kg）、低剂量组（210 mg/kg）灌胃不同浓度的复合茶汤。小鼠饲养在温度为20℃～26℃、相对湿度50%～60%的老鼠房内；小鼠灌胃体积为0.1 mL/10 g，每周根据其称重体积调整灌胃量，隔天更换一次垫料，每周更换饮用水。

1.5 样品制备

实验周期1个月，结束后取小鼠肝组织，用预冷的生理盐水将血液漂洗干净。准确称取50 mg小鼠肝组织，加入1 000 μL预冷提取剂（70%的甲醇水溶液，含1 μg/mL的2-氯苯丙氨酸作为内标），进行涡旋匀浆1 min，冷冻静置 15min；离心 10min（4℃、12000r/min），取上清液于进样瓶，待检测。

1.6 色谱质谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLCHSS T3C18（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A相为超纯水（0.04%乙酸），B相为乙腈（0.04%乙酸）；洗脱梯度：0 min水/乙腈（95∶5体积比），11.0 min为5∶95体积比，12.0 min为5∶95体积比，12.1 min为 95∶5体积比，14.0 min为95∶5体积比；流速0.4mL/min，柱温40℃；进样量2μL。

质谱条件：电喷雾离子源（electrospray Ionization，ESI）温度 500℃，质谱电压+5500V（正），-4500V（负），离子源气体I55，气体II（GS II）60 psi（1 psi=6.895 kPa）。

1.7 数据处理

利用Analyst1.6.3软件及三重四极杆质谱的多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）处理质谱数据及进行定量分析，对所有代谢物进行峰提取和峰校正。所有数据集经过处理后用正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型进行分析，以预测参数R2X、R2Y和Q2的值来评价模型的有效性，它们的大小直接反映了模型的可靠程度。

2 结果与分析

2.1 数据质量评估

将3组样品混合制备成质控样本（quality control sample，QC），分析样本在同样处理方法下的重复性。利用软件Analyst 1.6.3进行峰的积分和校准模式得到图1。

图1 混样质控QC样本的总离子流图及MRM代谢物检测多峰图Fig.1 Total ion flow pattern and MRM metabolite detection of QC samples with mixed quality control

2.2 代谢物的定性和定量分析

经过代谢物的定性和定量分析，共检测到121个有机酸及其衍生物，包括尿囊素、（S）-2-羟基丁酸、2-氨基乙烷磺酸/牛磺酸、3-羟基丙酸、DL-甘油醛-3-磷酸、二羟丙酮磷酸、阿斯巴甜、咖啡酸、肉桂酸、L-乳酸、扁桃酸、D-羟基丙酸、尿刊酸、糠醛等物质。

2.3 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）二维得分图和三维图见图2。

由图2可知，主成分分析的质量控制和处理表明，每组茶样处理内样品间的差异都很小，样品具有相似的代谢特性，测试结果稳定且可重复。此外，茶样处理之间的分离趋势很明显，表明处理组之间存在明显的代谢差异；3组处理的代谢在第一组分（PC1）中能够分离，表明茶样处理对高脂小鼠的有机酸代谢的影响明显。

图2 主成分分析（PCA）二维得分图和三维图Fig.2 Principal component analysis（PCA）two dimensional score map and three dimensional graph

对于DH、DL组的样本不能完全聚在一起形成独立的区域，但与NK组相比部分分离，表明模型组与低浓度茶样处理组、高浓度茶样处理组小鼠在代谢上具有一定的差别。DL、DH组分离趋势不显著，表明茶样处理组之间的代谢成分相似。

2.4 正交偏最小二乘判别分析

通过正交信号校正（orthogonal signal correction，OSC）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）将X矩阵信息分解为Y相关和不相关[18]，为了筛选差异变量，消除不相关的差异。PLS-DA可最大程度地区分组间差异，更有助于发现差异代谢物。OPLS-DA模型的评分、验证图、S-plot见图3。

图3 OPLS-DA模型的评分、验证图、S-plotFig.3 Scoring，validation and S-plot of OPLS-DA model

由图3可知，R2Y和Q2分数均大于0.99，表明茶样处理导致高脂小鼠的有机酸代谢差异。通过200次随机排列组合验证试验证明了OPLS-DA模型的可靠性，水平线对应于原始模型的R2和Q2；而红色和蓝色点分别代表替换后的R2’和Q2’，验证结果表明该模型是有意义的，且可以在随后的分析中根据特征变异投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析来筛选差异代谢物。

与模型组相比，低浓度茶样处理组咖啡酸、磷酸二羟丙酮、乙酰水杨酸差异明显，高浓度茶样处理组咖啡酸、牛磺酸、肉桂酸差异明显。表明经不同浓度复合茶处理后有机酸代谢物质变化明显。

2.5 层次聚类分析与火山图

差异代谢物的火山图、VIP值图、相关性热图、韦恩图、条形值图见图4。

图4 差异代谢物的火山图、VIP值图、相关性热图、韦恩图、条形值图Fig.4 Volcano map，VIP value map，correlation heat map，Wayne map and bar value map of different metabolites

层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）可以评估茶样处理导致高脂小鼠有机酸代谢物积累的特征差异，包括处理内的同质性和处理间的变异性。由图4可知，随着复合茶浓度的增加，代谢物的表达差异也增大。由差异代谢物火山图可知，大多数代谢物的表达没有太大差异，上调和下调的差异代谢物个数相近；NK比DL组中发现差异代谢物上调3个、下调6个，NK比DH组中发现差异代谢物下调13个，DL比DH组中发现差异代谢物上调1个、下调10个。

2.6 差异代谢物的统计分析

差异显著的代谢物见表1。

表1 差异显著的代谢物Table 1 The metabolites with significant difference

由表1可知，检测到有机酸及其衍生物121个。与高脂模型组相比，高浓度茶样处理组中（S）-2-羟基丁酸、2-羟基-4-甲基戊酸、D-羟基丙酸、DL-甘油醛-3-磷酸、磷酸二羟丙酮等13个代谢物显著下调；低浓度茶样组中（S）-2-羟基丁酸、DL-甘油醛-3-磷酸、磷酸二羟丙酮、糠醛、咖啡酸、尿刊酸6个代谢物显著下调，羟基异己酸乙酯、咖啡酸、N-油酰甘氨酸3个代谢物上调。

与低浓度茶样组相比，高浓度茶样组中2-羟基-4-甲基戊酸、磷酸二羟丙酮、DL-甘油醛-3-磷酸、5-羟基己酸等10个代谢物下调，咖啡酸1个代谢物上调。与高脂模型组相比，不同浓度茶样处理之间发现（S）-2-羟基丁酸、糠醛、DL-甘油醛-3-磷酸、磷酸二羟丙酮这两个有机酸及其衍生物均为下调。

2.7 差异代谢物的功能注释与富集分析

差异代谢物的功能注释与富集分析见图5～图7。

图5 差异代谢物的功能注释和富集分析Fig.5 Functional annotation and enrichment analysis of different metabolites

图6 茶样处理高脂小鼠肝脏有机酸代谢反应Fig.6 Metabolic reaction of organic acids in liver of high fat mice treated with tea

图7 茶样处理高脂小鼠肝脏中某些重要物质的代谢途径示意图Fig.7 Metabolic pathway of some important substances in the liver of high fat mice treated with tea sample

根据通路归属分析定位差异代谢物对应的代谢途径，其在生物体内相互作用，形成不同的通路，寻找到组间有差异的代谢途径。利用KEGG数据库对差异代谢物进行注释，并展示差异代谢物主要参与次生代谢物的代谢途径和生物合成[19]。如磷酸二羟丙酮、D-羟基丙酸、L-乳酸、糠醛、咖啡酸、尿刊酸等物质。这些代谢物含量的变化与新陈代谢、磷酸肌醇代谢、糖酵解/糖质新生、丙酮酸代谢、糠醛降解、胰高糖素信号通路、果糖和甘露糖代谢有关，说明其可能参与肝细胞糖原的分解，从而在维持体内血糖稳态的重要代谢过程中发挥重要作用。

差异代谢物KEGG通路图见图8。

图8 差异代谢物KEGG通路图Fig.8 KEGG pathway of different metabolites

3 讨论

苦丁茶中富含二咖啡酰基奎宁酸异构体和三萜皂苷等有机酸及其衍生物，具有降血脂、抗氧化、杀菌减脂作用，因此可以用作降脂[13]。金银花是一种常见的中药材，经过现代药理学证实金银花具有抗菌、抗氧化，护肝等功效[20]。金银花中主要有效成分为绿原酸类化合物，其他有机酸还包括咖啡酸及棕榈酸[21]。在本研究中，与模型对照组相比，低浓度茶样处理导致咖啡酸等有机酸的下降。绿原酸属于缩酚酸，由咖啡酸与奎尼酸生成，具有缓解血清中谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、ALT、总胆红素（total bilirubin，TBIL）和总胆汁酸（total bile acid，TBA）升高，调控肝胆转运体和代谢酶的表达，降低胆汁酸对肝细胞的毒性等功能，从而起到肝保护作用[22]。在本研究中，与低浓度茶样处理组相比，高浓度导致咖啡酸含量的上升。理论上这一通路的表达原本会造成咖啡酸的降低，但高浓度处理结果上升，具体分析还有待进一步研究。

与模型对照组相比，低浓度茶样处理后检测到尿刊酸下调，而高浓度茶样处理组并未检测到。已经证明，尿刊酸是L-组氨酸分解代谢的中间体，与组氨酸代谢有关，在茶样处理后的该物质的变化具有一定作用。组氨酸磷酸酶具有去磷酸化作用，其失调可导致心情郁闷、抑郁症等。在大多数细胞信号转导通路中组氨酸磷酸酶起着至关重要的作用，可作为一种生物标记物，为疾病的诊断与治疗提供新的思路与治疗靶点[23]。

磷酸二羟丙酮是联络甘油和葡萄糖的化学物质，主要参与糖酵解、甘油异生、丙酸盐代谢以及果糖和甘露糖代谢等新陈代谢过程。在本研究中，与模型对照组相比，茶样处理组间导致磷酸二羟丙酮下调，以及与低浓度茶样处理组相比，高浓度茶样处理中磷酸二羟丙酮下调。这可能意味着随着茶样浓度增加，糖酵解、甘油异生、丙酸盐代谢以及果糖和甘露糖代谢等新陈代谢作用增加，从而导致小鼠血脂降低，改善血脂紊乱。