基于方证相关探寻气、血虚证物质基础的蛋白质组学研究

梁华，梁尔新，李奇玮，闫起，王燕，李泽光

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

方剂是研究治法与配伍规律及其临床运用的学科，其功用效果的发挥与证侯密切相关。以方测证体现了中医学辨证论治的思想，通过病、证动态演变特性来研究方剂与证候之间的相互关系。随着现代医药科技迅猛的发展，特别是蛋白质组学(Proteomics)作为研究生理条件、突变情况及对抗外部因素产生应变的有力工具，能够对于生物系统之间复杂作用及行为的系统生物学进行描述和预测[1],其具有较为出色的特征表现，诸如复杂性、整体性以及动态性等。这一点也和中医学的观念保持高度一致。为了明确经典名方四君子汤、四物汤[2]的抗衰老机制[3-9],本研究采用经典名方补益气、血剂干预自然衰老小鼠肝细胞线粒体蛋白质组的变化，探寻自然生长小鼠增龄过程中伴随气、血虚证的物质基础，为指导临床辨证用药提供科学依据。

1 材料

1.1 动物

SPF级40只ICR雌性小鼠，购自辽宁长生生物有限公司，许可证号:SCXK(辽)2010-0001。小鼠的饲养要求均为自然光照条件，室内温度(22±2)℃，相对湿度55%±20%，对所有小鼠进行固体饲料饲养，自由摄食、饮水。

1.2 药物

补气剂四君子汤：白术9 g，人参9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，共33 g;补血剂四物汤：熟地黄12 g,当归9 g,白芍药9 g,川芎6 g,共36 g。制备方法：所有药物加水浸泡后，加入10倍量水，分两次进行煎煮，时长1 h，将煎煮后的药液合并，浓缩至100 mL备用，补气剂药液浓度配置为0.33 g/mL，补血剂药液浓度配置为0.36 g/mL，使用前加温至37 ℃。

1.3 主要试剂

SDS、DTT、过硫酸铵、Urea、IAA、TEAB均来自美国Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、银染试剂盒来自中国碧云天生物技术公司；ACN来自德国Merck KguA Darmstadt公司；二抗来自美国Santa Cruz；Monoclonal Anti-GAPDH antibody produced in mouse来自美国SIGMA 技术有限公司；iTRAQ Reagents-8plex来自美国AB Sciex公司。

1.4 主要仪器

电子分析天平AL204(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；离心机(德国，eppendorf)；pH计(德国，inoLab)；蛋白电泳仪(美国，Bio-Rad)；冷冻干燥机(美国，Thermo Scientific)；超低温冰箱(美国，Thermo Fi-sher)；安捷伦液相色谱仪1290 Infinity(美国，Agilent Technologies,Inc.)。

2 方法

2.1 实验动物分组

40只SPF级ICR雌性小鼠，其中3月龄以及16月龄小鼠的数量分别为10只、30只。随机选取10只3月龄雌性小鼠为空白组;30只16月龄雌性小鼠随机分为模型组、四君子组、四物汤组，每组10只。

2.2 给药方法

四君子汤组、四物汤组每天灌胃给药剂量为13 mL/kg，空白组及模型组灌胃生理盐水，剂量为13 mL/kg。

2.3 样品处理

第30天禁食、自由饮水，经过24 h，处死小鼠，方式为颈椎脱位法，取材部位为完整肝脏，然后用冰生理盐水清洗肝组织，用滤纸吸干水分,将肝组织剪成小块后放入液氮中快速冷冻处理，保存至-80 ℃冰箱冻存待用。在进行样本检测前，选择肝脏组织大小约为50～100 mg，剪切处理后于冰浴上进行匀浆，同时添加PMSF的线粒体分离试剂A，4 ℃ 15 000 r/min离心5 min，取其上清液，再次4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，获取的沉淀就是线粒体。

2.4 酶解和iTRAQ标记

采用FASP方法[10](蛋白滤膜辅助酶解)进行酶解，制取肽段。完成酶解后，使用100 μL TEAB buffe清洗2次，随后在其中加入1% FA，此时溶液的浓度是0.1%，充分混合后，每管中加入20 μL，随后对肽段冻干，在-80 ℃条件下冻存。冻干肽段样品各取20 μg用于iTRAQ标记。

2.5 肽段分级

样品溶解：100 μg的肽段用24 μL bufferA溶解，高速离心2遍，取20 μL上清液置于上样瓶中。

2.6 LC-MS/MS分析

应用Easy nLC1000和orbitrap Elite液质联用平台对iTRAQ标记样品进行数据采集。

2.7 生物学信息分析

使用Maxqunt软件，对来自Orbitrap Elite所获取的MS谱图进行分析，将数据归一化处理后，利用GO数据库的各节点映射进行富集分析，之后进行KEGG通路分析，对显著富集的通路，以KEGG网站提供的绘图模块进行渲染。

3 结果

3.1 蛋白定量结果

蛋白质含量与色氨酸的含量成正线性相关关系，因此可以通过测定蛋白质样品中的色氨酸含量来计算蛋白质的浓度。

3.2 聚丙烯酰胺凝聚电泳检测结果

分离胶的浓度12%，Marker上样量4 μg， 每个样品上样量15 μg，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果显示，蛋白质电泳结果条带清晰，定量较为整齐，降解较少，见图1。

图1 蛋白条带图

3.3 差异蛋白筛选

差异蛋白筛选以sign.level≥2为条件，结合差异倍数(FOLD CHANGE>1.2或FOLD CHANGE<0.83)及P<0.05进行蛋白标志物的筛选，确保结果有较为出色的可靠保障。空白组与模型组共鉴定出差异蛋白数量是496个，上调以及下调的数量分别是257个、239个；四物汤组有237个标志性蛋白质出现了良性回调；四君子汤组有256个标志性蛋白质出现了良性回调；同时受到四物汤组、四君子汤组影响的蛋白有493个。

3.4 Gene Ontology分析

Gene Ontology是组学实验常用的方法和工具，对研究有着极为重要的作用。本实验借助GO数据库富集分析，发现差异蛋白参与生物进程有类固醇代谢过程、蛋白质多泛素化、钙离子运输、mRNA加工、高尔基体、脂质代谢过程的正调控等，主要与胞外外泌体、细胞内核糖核蛋白复合物、高尔基体、核、细胞质等细胞组分有关；参与的分子功能有核苷酸结合、水解酶活性、氨肽酶活性、转移酶活性、聚(A)RNA结合等，见表1。

表1 差异表达蛋白GO分析富集结果(前5位)

3.5 KEGG Pathway分析

KEGG是基因组破译方面的数据库，用于了解生物系统的分子水平表达。本实验结果利用KEGG网站筛选的差异蛋白主要集中在内质网中的蛋白质加工、剪接体、脂肪消化吸收、细胞凋亡、阿尔茨海默病5条通路中，见表2。

表2 差异蛋白基因KEGG通路富集分析结果

4 讨论

中医学认为人体生命活动的物质基础是气和血，气对人体有推动、温煦、防御、固摄以及气化作用；血对人体有濡养以及化神作用。因此有“气为血之帅”“血为气之母”的理论。本课题组认为机体的衰老与气、血密切相关，同时发现小鼠饲养到16月龄后出现蜷缩少动、闭目、毛发脱落少光泽、鼠尾苍白等现象，存在着气血亏虚的症状。基于方证相关理论，我们认为通过补益气血剂可以改善衰老相关性证候[11]。本实验以蛋白质组学技术为依托，深入发现模型小鼠的肝细胞线粒体中存在与增龄相关的蛋白质生物标志物，经过补益气血剂干预后回调了493个差异蛋白。通过对以上差异蛋白生物学功能及通路情况的分析，探求补益气血剂与衰老进程中脾气虚证相关的物质基础。

实验结果可见，差异蛋白主要参与的生物进程有类固醇代谢过程、蛋白质多泛素化、钙离子运输、mRNA加工、高尔基体、脂质代谢过程的正调控等；参与的分子功能有核苷酸结合、水解酶活性、氨肽酶活性、转移酶活性、聚(A)RNA结合等；主要与胞外外泌体、细胞内核糖核蛋白复合物、高尔基体、细胞核、细胞质等细胞组分有关。

通路主要富集在内质网中的蛋白质加工、剪接体、脂肪消化吸收、细胞凋亡、阿尔茨海默病。

4.1 内质网中的蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)的调节

主要有以下蛋白参与了该途径：Wolframin、钙蛋白酶-1催化亚单位(Calpain-1 catalytic subunit)、蛋白质SEC13同源物(Protein SEC13 homolog)、内质网凝集素1(Endoplasmic reticulum lectin 1)、泛素结合因子E4 B ( Ubiquitin conjugation factor E4 B)。

Wolframin是由Wfs1基因编码而成的蛋白质。Wolframin蛋白主要生理功能是分泌、膜的运输、调控内质网钙以及加工。INOUE等[12]1998年第一次发现WFS1基因。WFS1基因定位于人染色体4p16.1，由8个外显子组成，其中最长片段是exon8，大约为2.6 kb。WFS1蛋白质或Wolframin蛋白质是WFS1基因编码的跨膜糖蛋白质[13],大约由890个氨基酸组成[14]。Wolframin蛋白质主要位于内质网膜上,由细胞质N端亲水部分、内质网腔的C端亲水部分和中间疏水区域3个结构域，其包括了330～650的氨基酸[15]。YAMADA等人[16]发现小鼠胰岛中的活性X盒结合蛋白1以及PERK磷酸化水平升高是由于WFS1基因缺陷引发的，其分子伴侣表达量的增长体现了内质网应激水平的增长；其次还伴随着caspase-3裂解水平上升以及BrdU阳性细胞降低，并发现细胞周期的损伤和死亡都会比平时要快，导致此类现象的原因主是细胞周期的调节因子P21CIP1升高所致，但过度表达P21CIP1是影响细胞数量减少的主要原因，同时也表明P21CIP1的升高和WFS1基因缺陷胰岛中β细胞数量减少。SHANG等[17]将Wolfram综合征患者身上的皮肤纤维细胞体外诱导为多能干细胞，促使其能够分化为β细胞, 进而发现缺陷的β细胞中胰岛素含量在逐渐减少, 而内质网应激水平则会提升，在PERK、内质网跨膜蛋白肌醇激酶1和ATF6这3条主要的UPR通路活性都会相应提升：分子伴侣4-苯基丁酸能协助进行蛋白折叠, 这对于降低UPR信号通路活性具有帮助, 不仅如此，还能提升细胞内的胰岛素，这表明WFS1基因对于β细胞具有一定的保护作用，见图2。

4.2 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)的调节

主要有以下蛋白参与了该途径：钙蛋白酶-2催化亚单位(Calpain-2 catalytic subunit)、钙蛋白酶-1催化亚单位(Calpain-1 catalytic subunit)、去整合素和含10蛋白的金属蛋白酶结构域Amyloid-beta A4 protein淀粉样βA4蛋白(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、线粒体细胞色素C氧化酶亚基7C(Cytochrome c oxidase subunit 7C, mitochondrial)、1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶β-3(1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-3)、BH3相互作用域死亡激动剂(BH3-interacting domain death agonist)、半胱天冬酶-7(Caspase-7)。

钙蛋白酶-2催化亚单位(Calpain-2 catalytic subunit)是由Capn2基因编码而成的蛋白质，属于钙蛋白酶超家族的主要成员之一。钙蛋白酶是一种降解肌纤维蛋白依赖钙离子、半胱氨酸的蛋白酶，在动物组织中广泛存在。钙蛋白酶系统主要的参与对象是磷酸酶、细胞骨架、细胞凋亡、蛋白激酶以及激素受体。病理状态下, 异常的钙离子浓度能激活Calpain，进而造成组织损失从而影响了酶和蛋白质结构，并对细胞骨架、蛋白激酶产生降解作用。诊断阿尔茨海默病(AD)主要包括β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)浓度降低、细胞内的神经纤维缠结 (neurofibrillary tangle, NFT)。研究表明Ca2+信号异常是引发Calpain过度激活直接或间接影响AD的大脑病变[18]。LOPES等[19]研究发现大鼠脑皮层神经元通过Aβ40和prp106-126处理后，引发CDK5的异常，由合成胎处理后p25水平显著增强，CDK5的抑制剂与钙蛋白酶的抑制剂可改变tau蛋白的过磷酸化且能有效阻止神经元死亡。

半胱天冬酶-7(Caspase-7)是由Casp7基因编码而成的蛋白质，其酶活性是完成凋亡细胞死亡所必需的，属于半胱天冬酶的一个亚型结构。半胱天冬酶家族在哺乳动物的细胞凋亡途径及细胞内凋亡信号的诱导、转导和扩增中起着重要作用。Caspase3、Caspase6、Caspase7是Caspase家族中的凋亡执行因子。申雷娜[20]通过对早期胎停的绒毛组织中细胞凋亡情况进行检测发现Caspase3、Caspase7对早期胎停的调控是通过凋亡路径，并可作为妊娠初期筛查胚胎停止发育病因的分子标记物，见图3。

结合上述观点分析可知，补益气血剂在抗衰老方面有着积极意义, 本文从蛋白质组学视角出发，就自然衰老小鼠中补益气血剂干预价值进行分析。通过研究指出，16月龄模型组小鼠肝组织样本中蛋白质标志物与3月龄空白组存在差异；补益气血剂对16月龄小鼠肝组织内质网中的蛋白质加工、剪接体、脂肪消化吸收、细胞凋亡、阿尔茨海默病等途径具有调节作用。通过调节这些信号通路的相关蛋白，进而对增龄产生的相关机体功能紊乱起到保护和调节作用。