敲低CDCA8基因表达对膀胱癌5637细胞吡柔比星敏感性的影响

高 鑫，陈 美，王新彤，刘明月，张淑芳

0 引 言

膀胱癌作为泌尿系统中具有较高的致死率和复发率的恶性肿瘤之一，其发病率一直居高不下[1- 2]。经尿道膀胱肿瘤切除术是非浸润性膀胱癌常用的手术方式，术后患者需常规应用化学药物灌注化疗，常用药物就包含蒽环类药物[3-4]。吡柔比星(THP)是新一代半合成蒽环类抗肿瘤药物，具有较强的抗癌活性，已成为临床膀胱癌治疗常用化疗药物。有研究表明，仍有10%～30%的THP化疗患者在5年内复发和转移[5]，然而，目前膀胱癌复发和耐药机制仍未完全清楚，因此，从分子层面研究膀胱癌的分子机制有助于寻找膀胱癌治疗分子靶标。

细胞分裂周期相关蛋白8(cell division cycle associated 8，CDCA8)是CDCA蛋白家族八个成员(CDCA1-8)中的一种[6]。CDCA蛋白可参与癌症细胞的有丝分裂、交叉染色体分离和分裂的调控[7]。CDCA8是脊椎动物染色体乘客复合体(chromosomal passenger complex，CPC)的重要组成部分，也是细胞有丝分裂的必需调节因子[8]。CDCA8基因过表达也与胚胎干细胞和乳腺癌细胞生长有关[9]。此外，CDCA8基因的高表达还与乳腺癌[10]、肝癌[11]和肺癌[12]等多种肿瘤细胞的生长调控相关。本研究前期已证实了CDCA8在膀胱癌中高表达且与患者预后差显著相关，在膀胱癌细胞中敲低CDCA8表达可显著抑制膀胱癌细胞增值，促进癌细胞凋亡，还发现CDCA8在膀胱癌中的高表达与抑癌基因TP53和RB1的突变显著相关[13]。TP53基因的突变在低级肌肉浸润性膀胱癌患者中约占0%～14%，在高级别肌肉浸润性膀胱癌患者中约占24%～56%，且TP53突变会降低膀胱癌对蒽环类药物治疗的敏感性[14]。因此，本研究将重点研究敲低CDCA8表达对膀胱癌5637细胞THP敏感性的影响，为研究膀胱癌THP耐药机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 公共数据的获取和分析从TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载膀胱癌的mRNA表达谱数据，利用R语言“TCGAbiolinks”包下载TCGA数据库膀胱癌灌注化疗信息。从获取的表达矩阵中提取CDCA8基因表达数据并与化疗信息合并，用于后续分析。采用GEPIA在线工具(http://gepia.cancer-pku.cn/)可视化CDCA8基因在TCGA中的表达[15]。将TCGA数据库中治疗登记信息登记信息为“Chemotherapy”的患者和“Immunotherapy”的患者分为化疗和未化疗；化疗方案分为使用过蒽环类者与未使用过蒽环类药物的患者。对用过蒽环类药物化疗登记为 “Stable Disease” 和“Partial Response”的患者出现肿瘤稳定及部分反应为耐药及部分耐药组，用过蒽环类药物化疗登记为“Complete Response”的患者出现完全反应为敏感组。

1.2样本收集和免疫组化收集2018年1月至2020年12月中南大学湘雅医学院附属海口医院膀胱癌组织患者的样本。纳入标准：术后组织病理学确诊；术前无转移；无其他恶性疾病；没有术前抗癌治疗。排除标准：没有完整的后续数据(含化疗用药信息)。每个样品均在采集时经过液氮速冻处理，后续使用石蜡包埋切片。

首先将组织切片放入63 ℃烘箱中1 h，然后进行脱蜡流程：二甲苯中15 min，无水乙醇7 min。接下来使用DAKO全自动免疫组化预处理系统仪器修复。修复后取出片子，用PBST缓冲液冲洗3次，1 min/次；将一抗按照稀释度用抗体稀释液稀释(按抗体说明书的要求稀释度进行)；滴加一抗，室温孵育，计时30 min或4 ℃冰箱过夜。将片子用PBST缓冲液冲洗3次，1 min/次，然后加入二抗；在片子上滴加稀释后的DAB，观察显色强度，最长显色10 min，到时后水洗5 min。在片子上滴加哈氏苏木精(SIGMA)1 min，时间到后在0.25%的盐酸乙醇(400 mL 70%乙醇+1 mL浓盐酸)中浸没≥2 s，用自来水冲洗>2 min，室温晾干后封片。

1.3细胞培养从上海中科院生命科学研究所购买人类5637膀胱癌细胞株。在5% CO2、37 ℃且湿度适宜的环境中使用含有10～15 mL 10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养，每3天换一次培养基。用PBS清洗对数生长期细胞3次并使用0.25%的胰蛋白酶消化下来。将细胞悬液分别接种到6孔板中，为后续实验做准备。

1.4细胞转染将膀胱癌5637细胞分为空白组(未作处理)、阴性对照组(转染不含CDCA8靶序列的慢病毒)和实验组(转染含CDCA8靶序列的慢病毒)，当6孔板内的细胞密度达到15%～30%左右时进行慢病毒转染，本研究使用的慢病毒载体由上海吉凯公司合成。本实验选择的CDCA8基因的靶点序列为(实验组)：5′-TTGACTCAAGGGTCTTCAA-3′，GC含量为42.11%；RNAi阴性对照序列为(阴性对照组)：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，GC含量为52.63%。转染时MOI=10，实验组和阴性对照组病毒用量均为2 μL，病毒滴度均为5×108TU/mL。完成转染后，继续在37 ℃和5%CO2培养箱中培养72 h左右，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白报告基因(green fluorescence protein，GFP)的在细胞中的表达，此外，通过RT-qPCR和WB来验证siRNA转染效果，转染后的细胞用于后续实验。

1.5RT-qPCR分析转染72 h后使用1 mL Trizol提取细胞总RNA，提取得到总RNA后采用M-MLV kit(Promega；上海，中国)进行cDNA逆转录。取1 μL OligodT(0.5 μg/μL) 和2.0 μg Total RNA加入PCR体系中，最后补充H2O至10 μL。引物为：CDCA8上游：GCAGGAGAGCGGATTTACAAC，下游：CTGGGCAATACTGTGCCTCTG；GAPDH上游：TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。循环条件为在95 ℃下5 min，接着是50个循环的95 ℃持续30 s和60 ℃持续45 s，最后一步为72 ℃持续30 min。

1.6免疫印迹分析在细胞转染72 h后处于对数生长期的膀胱癌5637细胞样品用PBS洗涤3次，然后用RadioImmunoprecipitation Assay (RIPA) lysis buffer缓冲液进行裂解，在冰上使用200W超声破碎细胞，反复4次(持续5 s/次)，每次间隔2 s；在4 ℃、12 000×g的条件下，离心15 min后取上清液用BCA 试剂测定蛋白浓度；使用SDS-PAGE分离总蛋白，分离胶为10%的polyacrylamide sequencing gel，然后将蛋白质转移到经过5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1 h的PVDF膜上。CDCA8抗体(Abcam，上海，中国)用PBS稀释，与封闭的PVDF膜在室温下孵育2 h或4 ℃过夜，然后用TBST洗涤4次，8 min/次。二抗用PBS稀释，用PVDF膜室温孵育1.5 h，然后用TBST洗涤4次，每次8 min。最后，将PVDF膜置于暗盒中加入A、B混合溶液，使用X线片曝光显影。

1.7Celigo检测5637细胞吡柔比星IC50使用胰蛋白酶将处于对数生长期的5637细胞消化后，使用完全培养基重悬成细胞悬液并计数；铺板细胞密度为3500 cell/孔，细胞密度根据根据细胞生长快慢决定。每组3复孔，培养体系为150 μL/孔，要尽量保证每孔加入细胞数目一致，培养箱培养条件为37 ℃、5% CO2。铺板后第2天，根据THP浓度0、2.5、5、10、20、40、80、160、240和480(单位：nmol/L)分组对细胞进行加药处理；最后放入培养箱培养72 h后，用Celigo检测读板，每组3个重复。

2 结 果

2.1CDCA8在膀胱癌化疗患者中的表达变化膀胱癌中CDCA8表达(10.332±1.022)相对于正常组织(7.156±1.941)显著高表达(P<0.05)。膀胱癌化疗CDCA8表达(10.369±1.131)较非化疗(9.250±0.892)显著高表达(P=0.012)。蒽环类药物化疗组CDCA8表达(10.253±1.088)高于非化疗组(9.751±1.073)，耐药及部分耐药组CDCA8表达(10.375±1.107)高于敏感组(9.921±0.944)，差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化实验发现CDCA8在复发患者的染色强度高于初诊患者，见图1。

a:初发；b:复发

2.2慢病毒转染5637细胞敲低CDCA8表达结果显示转染效率达感染效率达80%以上，说明转染成功。qRT-PCT实验结果显示，实验组CDCA8的mRNA表达量(0.069±0.004)较空白组(1.087±0.075)、阴性对照组(1.001±0.054)显著降低(P<0.001)。免疫印迹实验结果所示，实验组CDCA8蛋白表达量也明显降低(P=0.003)。以上结果说明构建的慢病毒成功敲低CDCA8基因表达，可用于后续研究。见图2、图3。

a:明视野；b:荧光视野

图 3 敲低膀胱癌5637细胞中CDCA8基因表达

2.3敲低CDCA8对膀胱癌细胞THP敏感性的影响实验组的IC50明显低于其他两组，细胞抑制率显著高于其他两组(P<0.05)。说明敲低CDCA8表达后增强了膀胱癌5637细胞对THP的敏感性。见图4。

a:空白组IC50；b:阴性对照组IC50；c:实验组IC50；d:三组细胞THP抑制率比较

3 讨 论

膀胱癌已成为世界上重要的健康问题之一。在所有膀胱癌病例中，超过75%的病例为非肌层浸润性膀胱癌，然而，近四分之一的非肌层浸润性膀胱癌患者最终发展为肌层浸润性膀胱癌，因为其复发率高且存在化学抗性[16]。随着研究的深入，人们逐渐发现膀胱癌的发展和耐药机制涉及多分子层面和多种通路，是一个及其复杂的过程[17-19]。膀胱癌的发展及耐药与基因异常表达密切相关，如CXCL5基因可能通过激活NF-κB通路参与膀胱癌细胞化疗耐药性[20]；此外，膀胱癌发展及耐药常见异常调节通路还有p53信号通路、TGF-β信号通路和PI3K / AKT / mTOR信号通路等[21-23]。THP具有很强的细胞毒作用，是目前临床治疗膀胱癌常用化疗药物之一，术后进行THP膀胱灌注治疗有助于控制复发[24]。然而，最新的研究表明经THP治疗的膀胱癌患者复发率已经高达24.32%[25]。目前膀胱癌复发和耐药机制仍未完全清楚，因此，从分子层面研究膀胱癌的分子机制有助于寻找膀胱癌治疗分子靶标。

CDCA8是一种细胞周期分裂相关蛋白，在维持细胞生长中有着重要作用[26]。CDCA8基因可作为癌基因参与多种肿瘤细胞的增殖和恶性进展[6]。本研究前期研究结果已经证实CDCA8在膀胱癌中作为癌基因促进膀胱癌细胞的增值和转移[13]。目前，CDCA8在肿瘤领域耐药性相关研究仍较少，但已有的研究已经表明CDCA8可能参与了肿瘤的化疗耐药。已有研究将CDCA8识别为宫颈磷癌化疗耐药的关键基因之一[27]，此外，Qi等[28]在卵巢癌的研究中发现CDCA8的高表达参与了卵巢癌的肿瘤发生、侵袭性和化学耐药性，CDCA8沉默联合奥拉帕尼治疗可能有助于卵巢癌的治疗。然而，至今尚未有研究报道CDCA8的表达与膀胱癌THP耐药性的关系。本研究前期发现CDCA8高表达与抑癌基因TP53突变显著相关，已有研究表明p53通路与膀胱癌耐药的发生有关，特别是已有研究证实TP53突变与THP耐药相关，由于化疗药物通过 p53 依赖性细胞凋亡机制起作用，因此具有TP53突变的高级别肿瘤通常对化疗产生耐药性[12-13, 18]。这些发现促使我们进一步研究CDCA8表达与膀胱癌吡柔比星耐药性的相关性。本研究在前期研究的基础上，首先通过生物信息学方法获取TCGA数据库的膀胱癌表达谱数据和患者化疗信息，重点分析CDCA8 mRNA的表达与患者化疗的相关性，结果显示CDCA8在化疗患者中的表达显著高于未化疗患者，提取特定药物分析发现蒽环类药物化疗耐药患者的表达也高于敏感患者，与免疫组化结果基本一致。本研究还构建了慢病毒转染膀胱癌5637细胞后敲低CDCA8基因表达，与对照相比，敲低CDCA8表达的5637细胞IC50下降，THP对细胞的抑制率显著增加，说明5637细胞对THP的敏感性增强。

总之，本研究初步探索了CDCA8表达与膀胱癌THP的敏感性的关系，也为将来研究CDCA8参与膀胱癌耐药具体机制奠定了研究基础。然而，本研究的局限性在于缺乏THP耐药细胞模型的研究，以及CDCA8与膀胱癌THP耐药的相关性是否与TP53突变的有关还未得到验证，未来还需在更多膀胱癌细胞类型中进一步研究其耐药机制。