微泡辅助低频超声联合不同表面结构的纳米颗粒治疗前列腺癌原位瘤的增效作用

孟哲颖，张 杨，胡 兵，白文坤

0 引 言

前列腺癌是严重威胁男性健康的疾病，是老年男性最常见的肿瘤[1-3]。前列腺癌的临床治疗大致可分为内分泌治疗、根治性切除术、放射性核素疗法、化学疗法、免疫治疗[4]。根治性前列腺切除术是治疗局灶性前列腺最主要的办法，可以使得早期前列腺癌患者达到治愈效果，但是存在手术出血量大、尿失禁发生率高、勃起功能障碍的严重并发症[5]。内分泌疗法一直是临床一线重要的治疗方法，通过药物或者外科去势手术降低雄激素水平，从而导致雄激素敏感的前列腺癌细胞死亡[6]。但这种抗雄激素去势抵抗状态使患者很快进展为去势抵抗的雄激素非依赖性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)，同时可加速前列腺癌转移，是前列腺癌致死的重要原因[7]。因此需要一种安全、有效的治疗方法作为现有临床前列腺癌治疗的补充[8]。

近年来，随着学科交叉融合的发展，肿瘤纳米医学逐渐形成[9]。自从2000年以来，Pubmed上关于纳米颗粒的研究几乎每两年增加一倍，这表明肿瘤纳米医学受到越来越广泛的关注[10]。肿瘤纳米材料有效性的前提是在实体瘤内的有效富集，这也是目前肿瘤纳米药物临床转化面临的瓶颈问题[11]，即纳米颗粒在实体肿瘤内的递送效率低导致治疗有效性和安全性显著降低。此外，癌症类型显著影响肿瘤内纳米颗粒的积累，其中前列腺癌中递送效率尤其低[12]，据报道目前最高的递送效率仅为1.42%ID[13]。因此对于不耐受手术治疗的患者以及CRPC患者来说，改善纳米颗粒在前列腺癌实体瘤内的富集对于提高治疗效果具有重要意义[14]。本研究拟优化纳米颗粒为仿病毒结构以增强纳米粒表面粗糙程度；联合使用微泡辅助低频超声(microbubble-assisted low-frequency ultrasound, MAUS)验证其对纳米颗粒的肿瘤内富集、抗肿瘤治疗的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物5周龄 BALB/c雄性裸鼠。由上海市第六人民医院动物实验室提供，实验动物许可证号SYXK(沪)2016-0020。经上海市第六人民医院动物福利伦理委员会审核，伦理编号DWSY2020-0169。饲养环境为SPF级，自然光线，室温度约21～26 ℃，相对湿度40%～70% ，饲料经消毒灭菌，每周添料4～5次，自由进食。

1.2主要试剂与仪器高分辨透射电子显微镜购自FEI Tecnai G2 F20, FEI公司(美国)；高速离心机(TGL-16G，安亭科学仪器厂)；超声波分散仪，PS-40购自得康公司(中国)；恒温细胞培养箱购自HERACLL150i,Thermo公司(美国)；荧光显微镜，Olympus IX 70购自奥林巴斯(日本)；细胞24孔培养板购自无锡耐斯生物科技有限公司(中国)；25 cm2细胞培养瓶购自无锡耐斯生物科技有限公司(中国)；离心管(15 mL, 50 mL)购自Corning公司(美国)；烧瓶、烧杯、移液管等购自由上海交通大学附属第六人民医院中心实验室提供。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，99)购自sigma 公司(美国)；环己烷购自上海化工股份有限公司(中国)；氢氧化钠(NaOH，99%)购自上海化工股份有限公司(中国)；乙醇(99.8)购自上海化工股份有限公司(中国)；氯化铁(氯化铁6H2O，99)购自上海化工股份有限公司(中国)；柠檬酸三钠(99)购自上海化工股份有限公司(中国)；NaAc (99)购自上海化工股份有限公司(中国)；乙二醇(99.8)购自上海化工股份有限公司(中国)；氢氧化铵(28)购自上海化工股份有限公司(中国)；正硅酸乙酯(TEOS，99)购自阿拉丁实业有限公司(中国)；(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES，99)购自阿拉丁实业有限公司(中国)；三乙醇胺(TEA，98)购自阿拉丁实业有限公司(中国)；N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，98)购自阿拉丁实业有限公司(中国)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，98)购自阿拉丁实业有限公司(中国)；IR825(COOH,98%)购自新桥生物技术有限公司(中国)；聚乙二醇单丁醚(分子量2000)购自新桥生物技术有限公司(中国)；Ham′s F-12K购自上海源培生物科技有限公司(中国)；磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自上海源培生物科技有限公司(中国)；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司(美国)；青霉素/链霉素双抗购自Gibco公司(美国)；胰蛋白酶购自Gibco公司(美国)；支原体预防剂购自Invitrogen公司(美国)；PC-3细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库(中国)；超声微泡造影剂Sonovue购自BRACCO公司(意大利)；低频超声仪，500 kHz购自江苏百航公司(中国)；近红外激光器，825nm购自长春新工业光电科技有限公司(中国)。

1.3纳米颗粒制备制备表面修饰IR825的光滑、介孔、仿病毒表面结构的二氧化硅包裹内部磁性Fe3O4的特殊核壳结构纳米颗粒(magnetic Fe3O4coating with smooth/ mesopore/ virus-mimic structural silica nanoparticles，MSSN-IR825/MMSN-IR825/MVSN-IR825)。参照文献[15]制备Fe3O4纳米颗粒、MSSN纳米颗粒、MMSN纳米颗粒合成。MVSN通过单胶束外延生长法合成MVSN纳米颗粒：称取60 mg Fe3O4。采用聚乙二醇作为纳米颗粒的表面涂层。将25 mg PEG-COOH溶解在含有8 mg EDC、5 mg NHS的10 mL水中，并搅拌2 h。将预先分散在10 mL水中的制备的氨基修饰的纳米颗粒(20 mg)加入到活化的PEG-COOH溶液中，然后在搅拌下充分反应24 h。通过离心收集产物，用去离子水洗涤。FITC主要通过硫脲衍生物的形成与纳米颗粒表面相连。MSSN-IR825、MMSN-IR825、MVSN-IR825纳米颗粒合成：将PEG修饰的MSSN/ MMSN/ MVSN纳米颗粒MVSNs (20 mg)分散在乙醇(20 mL)中。然后，向混合物中加入1.0 mL IR825乙醇溶液(0.5 mg/mL)，并在避光条件中搅拌12 h。然后通过离心分离产物，并用乙醇洗涤。在45°C真空干燥后，获得MVSN-IR825、 MSSN-IR825、 MMSN-IR825。

1.4溶血实验取新鲜裸鼠血2 mL，1500 r/min离心3 min，离心半径30 cm，除去上清液，沉淀的红细胞再用PBS按上述方法洗涤3次至上清液不显红色为止。将所得红细胞用PBS配成2%的混悬液(弃上清液后取1 mL再加入50 mL的PBS)，供试验用。每EP管分别加入0.5 mL纳米颗粒和新鲜红细胞悬液0.5 mL。配置MSSN-IR825, MMSN-IR825, MVSN-IR825浓度分别为800 μg/mL，400 μg/mL，200 μg/mL，100 μg/mL，50 μg/mL和25 μg/mL。分别以去离子水和PBS作为阳性对照和阴性对照。轻轻混匀，后置37 °C静置孵育2 h，10 000转/min离心3 min，离心半径30 cm，吸取上清移至96孔板，在波长545 nm处测吸光度(A)值，取3次测量平均值计算溶血率。

溶血率(%)=(实验组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%

1.5组织器官切片HE染色随机选取4只4周龄健康裸鼠，尾静脉注射同体积等渗盐水saline，MSSN-IR825 (60 mg/kg)、MMSN-IR825 (60 mg/kg)、MVSN-IR825 (60 mg/kg)。24 h后腹腔麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾主要器官，用中性福尔马林固定液(10%)固定，石蜡包埋后进行切片、HE染色，最终切片通过光学显微镜观察各器官组织损伤情况。

1.6MAUS靶向肿瘤递送策略临床造影剂SonoVue每瓶含有六氟化硫气体和粉末，质量共计59 mg。注射入5 mL等渗盐水，充分摇晃，配置成六氟化硫微泡悬浮液。将50 μL微泡悬浮液与纳米颗粒(60 mg/kg)摇匀混合，通过尾静脉静脉缓慢注射，低频超声辐照肿瘤部位的辐照与静脉注射同时开始。静脉注射持续时间控制在大约1 min，超声辐照时间大约为2 min。为了充分辐照种瘤同时尽可能减少周围组织辐照，改良制作一个1.5 mL的EP管作为放置在超声探头和肿瘤之间的支架。超声波探头的表面和内部EP管填充耦合剂。

1.7PC-3原位瘤模型建立选择5周的雄性BALB/c裸小鼠。采用手术原位植入法建立原位前列腺肿瘤模型。前述PC-3细胞建立的皮下异种移植肿瘤用作为供体肿瘤。无菌环境下操作，将皮下移植瘤块裁剪至体积约为1 mm3，暂时放置于含青霉素-链霉素的等渗盐水中，放置在冰盒上。1%戊巴比妥钠麻醉裸鼠(45 mg/kg),下腹部用75%乙醇擦拭消毒，下腹部正中部位剪开约1 cm小口，轻柔暴露下腹腔，于膀胱后方找到精囊腺，其背侧可见肉色前列腺组织，将1 mm3包埋在前列腺中，逐层缝合关腹，手术部位表面再次涂碘伏消毒液。超声引导“十字”交叉法可对原位瘤的体表投影进行定位，帮助后续尾静脉注射给药同时进行靶向原位瘤的超声辐照。当肿瘤直径达到约4 mm开始实验。

1.8纳米颗粒富集监测采用Vevo LAZAR-2000进行光声成像。超声耦合剂通过以1500 r/min离10 min，离心半径30 cm，以除去耦合剂内气体，备用。对于肿瘤部位的在体PAI，利用单波长850 nm确定PA gain 值和TGC。然后固定在该PA增益和TGC下，选择850 nm波长采集。在感兴趣区域肿瘤区域测量的PA信号。为了保持数据可比性，每次实验深度、焦点位置、PA增益、TGC保持一致。荷瘤小鼠随机分为6组：MSSN-IR825组(仅尾静脉注射MSSN-IR825)、MSSN-IR825+ MAUS组(尾静脉注射MSSN-IR825，同时采用MAUS递送)、 MMSN-IR825 组(仅尾静脉注射MMSN-IR825)、 MMSN-IR825+ MAUS组(尾静脉注射MMSN-IR825，同时采用MAUS递送)、 MVSN-IR825组(仅尾静脉注射MVSN-IR825)、 MVSN-IR825+ MAUS组(尾静脉注射MVSN-IR825，同时采用MAUS递送)。每组5只，尾静脉前及给药后20h监测采集肿瘤光声信号。

1.9抗肿瘤治疗效果评价将小鼠随机分为等渗盐水组和激光辐照组，每组3只。对照组为单纯尾静脉注射相同体积的等渗盐水，不进行任何治疗；激光辐照组为尾静脉注射MVSN-IR825(剂量见靶向递送策略部分)，在注射20 h后开始激光辐照原位肿瘤治疗。原位肿瘤的生长采用临床超声(GE logic E9, 探头频率18 MHz)来动态监测。采用HE染色、Ki67染色分别评价肿瘤组织形态、增殖情况，治疗6 h后取出肿瘤组织，中性福尔马林固定、石蜡包埋切片、光学显微镜下拍片。采用DHE染色观察肿瘤组织活性氧产生情况，治疗6 h后取出肿瘤组织，迅速放入液氮中保存、冰冻切片、光学显微镜下拍片。

2 结 果

2.1 MSSN-IR825、 MMSN-IR825、 MVSN-IR825的性质评价成功制备了粒径均一的光滑、介孔、仿病毒三种不同表面结构的纳米颗粒。透射电子显微镜所示，MSSN-IR825、MMSN-IR825、MVSN-IR825粒径均一，粒径平均值分别约169 nm、 165.5 nm、 175.3 nm。可见表面为光滑、介孔以及仿病毒结构。仿病毒结构纳米颗粒MVSN-IR825大小均匀，由直径约为80 nm的球形磁性Fe3O4核和由长度约为20 nm、直径约为7 nm的垂直二氧化硅纳米棒形成的仿病毒二氧化硅壳两部分组成。见图1。

2.2生物安全性评价在4 mg/mL高浓度下，MSSN-IR825、MMSN-IR825、 MVSN-IR825的溶血率分别为20.3%、27.4%、11.2%，见图2。进而采用4 mg/ mL的浓度尾静脉注射MSSN-IR825、 MMSN-IR825、 MVSN-IR825(60 mg/ Kg)，24 h后取出小鼠主要器官进行HE染色。与对照组相比，MSSN-IR825组、 MMSN-IR825组、 MVSN-IR825组纳米颗粒小鼠器官组织学水平未见明显损伤，表明此浓度可作为后续体内实验条件。见图3。

图 1 不同表面结构纳米颗粒的透射电镜图

2.3光声成像的原位瘤内富集MVSN-IR825瘤内富集的光声信号明显多于MSSN-IR825和MMSN-IR825；当联合使用MAUS后，瘤内光声信号显著增强，见图4。因此选择使用MVSN-IR825联合MAUS靶向辐照原位瘤的给药策略进行后续激光辐照的抗肿瘤治疗。

2.4抗肿瘤效果超声监测激光辐照后的原位瘤大小所示，等渗盐水组原位瘤10 d后体积显著增加，激光辐照组的原位瘤大小得到明显抑制，见图5。DHE染色、HE染色、Ki67染色验证了基于MVSN-IR825在原位瘤内富集的有效抗癌治疗效果，见图6。与对照组相比，MVSN-IR825+MAUS组DHE染色可见明显活性氧产生的红色荧光，表明激光辐照后肿瘤组织内因为富集的MVSN-IR825而产生活性氧。HE染色可见肿瘤细胞部分破坏、Ki67染色表达相对降低，结果表明了组织学水平上的抗肿瘤效果的有效性。

图 2 不同表面结构纳米颗粒的溶血率评价

图 3 尾静脉注射三种纳米颗粒24 h后小鼠主要器官的HE染色(标尺:50 μm)

图 4 尾静脉注射三种纳米颗粒20 h后原位瘤PAI成像

图 5 超声监测治疗前后的PC-3原位瘤大小

图 6 肿瘤组织的DHE染色、Ki67染色和HE染色(标尺:50 μm)

3 讨 论

在肿瘤纳米医学中，增强渗透和滞留效应(enhanced permeability and retention, EPR)被认为是实体肿瘤中纳米颗粒被动滞留的最重要理论依据[16]，即大分子向肿瘤的选择性递送是基于实体肿瘤的生理异常，比正常血管更容易渗漏且由于淋巴引流不畅导致清除率差[17]，因此造成大分子药物的被动滞留。然而最近Nature Materials发表的一项研究表明[18]，纳米颗粒从血管转运到实体肿瘤是一个主动过程，通过内皮细胞跨内皮细胞机制发生，而不是被动地通过内皮间隙外渗。不管肿瘤内的纳米颗粒富集是被动转运抑或是主动转运，靶向肿瘤递送以增加纳米颗粒的瘤内富集的研究从未间断[19]。如何提高纳米颗粒在实体瘤内的富集是纳米材料临床转化的瓶颈问题[13]。

肿瘤细胞内化被认为是靶向肿瘤递送的重要环节。FDA批准应用的纳米颗粒治疗剂均含有作用于细胞内靶标的药物。已有研究报道常用的靶向配体如转铁蛋白、表皮生长因子可通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞发挥作用[20]。此外，纳米颗粒的形貌、大小对靶向肿瘤细胞的内化摄取具有重要影响[21]。当纳米颗粒具有相似的粒径、电荷和表面涂层时，表面结构会深刻影响纳米颗粒的外渗能力[22]。表面粗糙度可以大大增加纳米颗粒-生物界面的相互作用面积，并将静电、亲水等互斥作用(降至最低，从而促进纳米颗粒粘附，更容易被细胞吞噬[23]。因此，我们构建了仿病毒结构的纳米颗粒MVSN-IR825，同时合成了另外两种不同表面结构纳米颗粒MSSN-IR825、MMSN-IR825作为对照，本研究初步证实了表面结构优化为仿病毒样可以提高前列腺癌原位瘤内的纳米颗粒富集。

MAUS增强药物递送的具体机制仍不明确，但是既往大量研究表明MAUS在细胞水平的可能机制包括细胞膜的瞬时孔形成[24]、增强内吞作用[25]、和超声“打印”[26]。作为一种被动靶向递送策略，MAUS已被证实有利于基因或药物的在很多疾病模型的靶向递送，用于癌症[27-28]，和其他许多疾病模型[29]，脑卒中[30]，和心血管疾病[31]。研究发现，微泡辅助低频超声在体外能够导致前列腺癌细胞膜通透性增高，促进了绿色荧光蛋白及野生型P53基因的转染[32]。在体内转染时发现，未进行超声空化组无明显的基因转染及红细胞渗出，仅在微泡辅助低频超声组肿瘤实质内基因转染成功及可见红细胞渗出，说明前列腺肿瘤内的血-前列腺屏障在控制血与肿瘤组织物质交换方面仍然发挥着作用。本研究从在体动物水平，建立PC-3前列腺癌原位瘤模型，证实了MAUS的给药策略可以提高前列腺肿瘤内的血-前列腺屏障的通透性进而促进前列腺实体瘤内的纳米颗粒富集。

IR825既往作为光热剂和光敏剂，本研究也证实了通过激光辐照原位瘤内富集的MVSN-IR825，可产生良好的光热转换作用以及产生单线态氧，从而达到抑制前列腺癌的效果。但本研究仅使用了PC-3前列腺癌原位瘤模型，未来工作应该拓展到更多的肿瘤模型，并且争取使用人源性组织异种移植模型进行更充分得论证。本研究使用了500 kHz的低频超声是基于课题组前期关于超声促进基因递送的系列研究而选择，并未对其他频率的低频超声影响纳米颗粒的有效递送进行深入研究。本研究初步证实了MAUS在前列腺癌原位瘤递送的有效性，未来可对“低频超声频率、功率、作用时间对肿瘤内纳米载体富集的影响”进行细致研究。