hsa_circ_0007534/miR-498对NSCLC细胞增殖和迁移及侵袭的作用机制

漆 毅，姚檬娜，隋洪婷，林志国，岳丽玲

0 引 言

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌相关死亡的主要原因，约占肺癌病理的85%，通过早期诊断和治疗对提高患者的生存率尤为重要[1]。然而，肺癌进展的机制尚未完全明晰。环状RNA(circular RNA，circRNA)是内源性的RNA，其特征在于共价闭合环状结构，可参与调控真核生物的基因表达[2]。circRNA在组织中呈特异性表达，广泛参与机体的发育阶段或生物代谢过程[3]。有研究显示，circRNA与癌症的发生和进展密切相关，且circRNA可能通过靶向结合微小RNA(microRNA，miRNA)调控基因表达参与癌细胞生物学进程[4]，其中hsa_circ_0006948可靶向结合miR-490-3p抑制骨肉瘤细胞的发展[5]。circRNA在NSCLC细胞中的异常表达会引起NSCLC的发生和发展，有研究显示，hsa_circ_0007534在NSCLC组织样本和细胞系中均上调，下调其表达可有效抑制NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭能力，但其在NSCLC的作用机制尚不完全明确[6]。此外，有研究表明miR-498在NSCLC肿瘤组织和细胞中的表达显著降低，表明miR-498下调与肿瘤进展相关，暗示其可能是NSCLC治疗的潜在靶点，但其是如何参与NSCLC进展还未可知[7]。因此，本研究通过探究hsa_circ_0007534及miR-498在NSCLC细胞生物学行为中的作用，为进一步探究其在NSCLC中发挥的作用而奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料组织来源：80份NSCLC组织及80份距离病变组织约3 cm的癌旁正常组织，细胞来源：正常的支气管上皮细胞16HBE和NSCLC细胞系(A549、H358、H1581、H1975及H1299)均购自深圳华拓生物，货号依次是：HTX2577C、HTX3171、HTX1703、HTX2825C、HTX1702C及HT-X1713；裸鼠来源：30只6周龄BALB/c雌性裸鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号：SCXK(京)2019-0014，体重约18～25 g。裸鼠在室温20～24 ℃、相对湿度45%～70%、12:12 h明暗循环的环境中饲养1周。

试剂：DEME培养基购自上海LMAI Bio，货号：LM-P0523；胎牛血清购自美国HyClone，货号：SH30109.03；Trizol试剂购自美国GENMED，货号：GMS12279；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自南京Vazyme，货号：DD1205-01、A311-01；Transwell小室购自美国Corning，货号：3422；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海Beyotime，货号：P0013C、P0012；一抗细胞增殖相关抗原(Ki67/358 kDa)、E-钙粘素(E-cadherin/97 kDa)、N-钙粘素(N-cadherin/125 kDa)及β-肌动蛋白(β-actin)/42 kDa均购自英国Abcam，货号：ab16667、ab40772、ab76011及ab124964；沉默hsa_circ_0007534-siRNA-3与其对应的阴性对照(NC-siRNA)、miR-498抑制物(miR-498-inhibitor)与阴性对照(NC-inhibitor)、miR-498模拟物(miR-498-mimics)与阴性对照(NC-mimics)、hsa_circ_0007534野生型(Wild type，WT)和突变型(Mutant type，MT)等质粒均由上海生工生物工程科技有限公司合成；抗原修复溶液购自上海Beyotime公司，货号：p0081；过氧化物酶阻断剂购自北京Biodragon公司，货号：BF06060。

仪器：CFX96荧光定量PCR仪、GelDoc XR凝胶成像仪购自美国Bio-Rad；Multiscan酶标仪、EVOSTMM5000型荧光显微镜购自美国Thermo Fisher；DM4M光学显微镜、RM2235型切片机购自德国Leica；AE1202电子天平购自中国SOPTOP。

1.2方法

1.2.1 细胞培养正常的支气管上皮细胞16HBE与NSCLC细胞系(A549、H358、H1581、H1975及H1299)均在含有10%的胎牛血清的DEME培养基中于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.2.2细胞转染与分组将A549细胞接种于12孔板中(1×105个/孔)，待细胞生长融合度约70%时，将细胞依次分为：NC组(不做任何处理)、NC-siRNA组(转染NC-siRNA)、hsa_circ_0007534-siRNA-3组(转染hsa_circ_0007534-siRNA-3)、hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组(转染hsa_circ_0007534-siRNA-3和NC-inhibitor)及hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组(转染hsa_circ_0007534-siRNA-3和miR-498-inhibitor)，按照Lipofectamine 3000说明书转染48 h。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测hsa_circ_0007534、miR-498相对表达水平使用Trizol试剂分别提取各个组织及细胞中的总RNA，使用分光光度计测量RNA的浓度及纯度，通过反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，以cDNA模板，GAPDH、U6为内参进行qRT-PCR检测。使用2-ΔΔCT法计算hsa_circ_0007534与miR-498相对表达水平。经过前期预实验证实，hsa_circ_0007534在NSCLC组织或细胞中高表达，且在A549细胞中表达最高。另外，经研究证实，hsa_circ_0007534-siRNA-3沉默效率最高。

引物序列：hsa_circ_0007534引物：F-5′-GTGACGGAAATCCAATTGCACC-3′，R-5′-ATGGAA TTGCTGGCGAGTTG-3′；miR-498引物：F-5′-GGTTTGAAGCCAGGCGGTTTC-3′，R-5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6引物：F-5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R-5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH引物：：F-5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，R-5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.4双荧光素酶报告基因检测通过CircInteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)预测得到miR-498与hsa_circ_0007534存在靶标结合位点。hsa_circ_0007534-WT/MT分别克隆至psiCHECK2载体质粒中，构建hsa_circ_0007534-WT和hsa_circ_0007534-MT载体，将二者分别与NC-mimics与miR-498-mimics共同转染A549细胞48 h，使用荧光素酶活性检测试剂盒检测A549细胞的相对荧光素酶活性。

1.2.5CCK-8检测各组细胞增殖活力将A549细胞接种于96孔板中(1×105个/孔)，待细胞融合约60%～80%时候，按照1.2.2中方法转染各组细胞，48 h后向各孔中添加10 μL CCK-8溶液37 ℃下孵育2 h，在酶标仪450 nm处检测各孔A549细胞的吸光度(A值)。

1.2.6集落形成实验检测各组细胞的集落形成数将各组培养的A549细胞接种于6孔板中(1×103个/孔)，在37 ℃培养箱中培养14 d，隔天更换培养基，培养结束后，去除上清液，使用PBS冲洗3次，依次添加4%多聚甲醛固定、1%结晶紫染色，在显微镜下观察后拍照，计数含有≥30个细胞的集落数量。

1.2.7Transwell实验检测各组细胞的迁移及侵袭能力将各组培养的A549细胞使用不含血清的培养基悬浮(1×105个/mL)，吸取200 μL悬浮液置于基质胶包被的Transwell小室上室中，在下室中添加700 μL正常培养基，孵育24 h后，取出小室，擦去上室中未侵袭的细胞，使用多聚甲醛固定、结晶紫染色后在显微镜下观察拍照，计算各组细胞侵袭数量。

Transwell实验检测各组A549细胞迁移能力则需使用无基质胶包被的Transwell小室，其余操作方法相同。

1.2.8Western blot检测增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达水平收集各组培养的A549细胞，使用RIPA法提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白的浓度。通过10% SDS-PAGE分离蛋白，湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，添加一抗(Ki67、E-cadherin、N-cadherin及β-actin)在4 ℃下过夜孵育后，二抗室温孵育1 h。在成像系统上检测蛋白印迹。使用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，公式如下：

目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/β-actin蛋白的灰度值

1.2.9裸鼠异种移植将状态良好且稳定的各组转染后的A549细胞使用PBS调整细胞密度为5×106个/mL，与基质胶按照1∶1比例混合后，吸取50 μL A549细胞悬浮液皮下注射对应的裸鼠，每组注射6只。注射35 d后，通过CO2窒息对各组裸鼠实施安乐死。使用电子天平检测各组肿瘤组织的重量，游标卡尺测量肿瘤组织的长径(L)和短径(W)，计算肿瘤体积。

1.2.10免疫组化检测将取出来的肿瘤组织样本使用4%多聚甲醛固定后包埋于石蜡中。切成4 μm厚的肿瘤组织切片，并将切片固定在载玻片上。脱蜡后，将切片先与抗原修复溶液在室温下孵育10 min，后与内源性过氧化物酶阻断剂再孵育10 min。其次，在室温下与5%胎牛血清共同孵育1 h后，将组织切片与一抗(Ki67、E-cadherin、N-cadherin及β-actin)4 ℃孵育过夜，使用二抗反应30 min，添加DAB试剂处理30 min后使用苏木精染色10 min，最后使用显微镜在200倍下观测结果。

2 结 果

2.1 hsa_circ_0007534靶向miR-498的预测和验证结果图1显示，hsa_circ_0007534与miR-498存在靶向结合位点。通过双荧光素酶报告基因验证发现，与hsa_circ_0007534-WT+NC-mimics组细胞双荧光素酶活性(1.02±0.10)相比，hsa_circ_0007534-WT+miR-498-mimics组(0.46±0.08)显著降低(P<0.01)；而与hsa_circ_0007534-MT+NC-mimics组相比，hsa_circ_0007534-MT+miR-498-mimics组细胞双荧光素酶活性则无显著差异(P=0.997)。

2.2各组A549细胞中miR-498表达及增殖情况图2显示，与NC-siRNA组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3组A549细胞中miR-498相对表达水平显著增高，细胞增殖活力及集落形成数量明显降低(P<0.05)；与hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组A549细胞中miR-498相对表达水平显著降低，细胞增殖活力及集落形成数量明显增高(P<0.05)。

2.3各组A549细胞的迁移和侵袭能力图3和表1显示，与NC-siRNA组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3组A549细胞迁移及侵袭数量明显减少(P<0.05)；与hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组细胞迁移及侵袭数量明显增多(P<0.05)。

2.4各组A549细胞中增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达情况图4显示，与NC-siRNA组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3组A549细胞中Ki-67和N-Cadherin蛋白水平显著降低，E-Cadherin蛋白水平显著增高(P<0.05)；与hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组细胞中Ki-67和N-Cadherin蛋白水平显著增多，E-Cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。

图 1 hsa_circ_0007534与miR-498靶向结合信息

1：NC组； 2：NC-siRNA组； 3：hsa_circ_0007534-siRNA-3组； 4：hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组；5：hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组

图 3 Transwell实验检测各组A549细胞迁移、侵袭能力(结晶紫染色×200)

表 1 各组A549细胞迁移及侵袭细胞数量统计

1：NC组; 2：NC-siRNA组; 3：hsa_circ_0007534-siRNA-3组; 4：hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组；5：hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组

2.5下调hsa_circ_0007534靶向miR-498对裸鼠体内肿瘤的影响图5显示，与NC-siRNA组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3组肿瘤组织重量和体积均显著降低(P<0.05)；与hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组肿瘤组织重量和体积均显著提高(P<0.05)。与NC-siRNA组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3组Ki-67与N-Cadherin阳性细胞率降低，E-cadherin阳性细胞率增高(P<0.05)；与hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组相比，hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组Ki-67与N-Cadherin阳性细胞率增高，E-cadherin阳性细胞率降低(P<0.05)。见图6、图7。

1：NC组; 2：NC-siRNA组; 3：hsa_circ_0007534-siRNA-3组; 4：hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组；5：hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组

图 6 镜下观察各组肿瘤组织中Ki-67、E-Cadherin及N-Cadherin的表达(免疫组化染色 ×200)

1：NC组; 2：NC-siRNA组; 3：hsa_circ_0007534-siRNA-3组; 4：hsa_circ_0007534-siRNA-3+NC-inhibitor组；5：hsa_circ_0007534-siRNA-3+miR-498-inhibitor组

3 讨 论

NSCLC是临床上常见的高度恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率也在逐年提高[8-9]。NSCLC的高转移性和复发性导致患者的生存率不断下降，严重影响患者的生存和健康[10]。因其致病机制复杂，因此，深入探究NSCLC的作用机制极为重要。

CircRNA是一类非编码RNA，与传统的线状RNA不同，其广泛分布于小鼠和人类[11]。据报道，circRNA参与肺癌、胃癌及宫颈癌等多种肿瘤的发展过程，由于其重要的生物学功能，一些circRNA可作为疾病诊断的生物标志物[12]。已知，circRNA表达谱是鉴定新型肿瘤抑制因子和致癌circRNA及阐明其功能和机制的必要条件[13]。Zhang等[14]研究表明，hsa_circ_0007534在骨肉瘤组织和细胞中显著高表达，敲低其表达可显著抑制肿瘤细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭。Rong等[15]研究表明，hsa_circ_0007534在宫颈癌组织和细胞系中上调，下调hsa_circ_0007534表达可显著抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭，是宫颈癌治疗的潜在靶点。本研究结果显示，hsa_circ_0007534在NSCLC组织和细胞系中高表达，且下调其表达可显著抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭及Ki-67和N-Cadherin蛋白水平，上调E-Cadherin蛋白水平，与Qi等[6]人研究结果相一致。据报道，Ki-67是一种增殖标记蛋白，其表达水平可反映肿瘤细胞的增殖活性[16]。E-Cadherin和N-Cadherin蛋白属于钙黏家族，E-Cadherin到N-Cadherin的表型转变与肿瘤转移和侵袭的增强密切相关[17]。以上结果表明，hsa_circ_0007534可能通过调控增殖、迁移和侵袭相关蛋白进而参与调控NSCLC的发生发展过程。然而，hsa_circ_0007534在NSCLC中的调控机制尚不清楚。

miRNA是包括NSCLC等多种疾病发展的关键因素[18-19]，以往研究表明，circRNA含有多个miRNA结合位点，主要通过调控miRNA发挥功能，如：Cheng等[20]研究发现，circTP63通过竞争性结合miR-873-3p从而消除其对靶基因的抑制作用，进而促进细胞增殖；Xue等[21]研究发现，CircAGFG1通过海绵吸收miR-203进而增强NSCLC的上皮间质转化和转移。本研究通过生物信息学分析发现，miR-498可能是hsa_circ_0007534下游靶标位点，通过双荧光素酶证实，miR-498是hsa_circ_0007534的下游靶点，同时，下调hsa_circ_0007534的表达，可上调miR-498的表达，表明hsa_circ_0007534可负向调控miR-498表达。此外，本研究还发现，下调miR-498可部分逆转hsa_circ_0007534下调对NSCLC增殖、迁移和侵袭的抑制作用。以上结果表明，下调hsa_circ_0007534通过靶向上调miR-498的表达抑制NSCLC肿瘤的增殖、迁移和侵袭。为进一步确定NSCLC进展中hsa_circ_0007534/miR-498轴调控机制，本研究通过裸鼠体内异种移植，结果表明，下调hsa_circ_0007534可有效抑制肿瘤组织生长及Ki-67和N-cadherin表达，促进E-cadherin表达，而下调miR-498可部分逆转下调hsa_circ_0007534对肿瘤组织的抑制作用，表明hsa_circ_0007534与miR-498在调控NSCLC发生发展中密切相关。

综上所述，下调hsa_circ_0007534通过靶向上调miR-498抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭，本研究结果为NSCLC的治疗提供了一个新的思路。然而本研究并未探究hsa_circ_0007534上调对miR-498表达的影响；其次，hsa_circ_0007534是否还调控其他miRNA参与NSCLC的发展以及其调控miR-498对细胞凋亡等生物学行为的影响；最后，本研究仅是初步探究了hsa_circ_0007534与miR-498在动物体内的功能，仍需后续更进一步的深入探究。