未成熟树突状细胞对肝纤维化抑制作用的研究进展

徐 杨，陈 鹏，刘 锋综述，胡明道审校

0 引 言

肝受到各种因素损伤、炎症引起肝星状细胞(hepatic stellate cells , HSCs)的激活，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)积聚，发生进行性纤维化，进而发展为肝硬化甚至是肝细胞癌。到目前为止，还没有特效药能够治愈肝纤维化，这成为影响人民公共卫生健康的重大问题。近些年科研人员使用四氯化碳(CCl4)、硫代乙酰胺、胆管结扎、3，5-二乙氧羰基-1，4-二氢氯和高脂饮食等构建了的常见的肝纤维化模型[1]。发现在纤维化过程中进行干预，肝脏组织结构能够有所恢复，因此在肝纤维化阶段进行治疗，以防止疾病的发展是非常重要的。

树突状细胞(dendritic cells ，DC)功能取决于它的成熟状态及表型特征。DC与其他免疫细胞相比，数量很少，但是全身的各组织、器官均有它的分布，是调理人类免疫功能的重要环节。DC的形态和表型与其所处的环境以及所接受的刺激有很大的关系[2]。在稳定期，大部分DC是呈现一个稳定或未成熟状态，当遇到外来抗原或者其它炎性刺激时经过信号特异性传导和转录编程等一系列复杂的过程开始成熟[3]。我们发现DC在不同阶段对肝纤维化的作用不同，imDCs能够对肝纤维化的消退起一定的作用，而mDCs则会加速纤维化的进展，因此本文将从纤维化形成，imDCs的诱导以及imDCs对纤维化抑制作用的机制这3个方面展开讨论。

1 肝纤维化的发生机制

纤维形成的目的是促进伤口愈合，但纤维形成通路的过度激活会导致纤维化的发生。尽管肝纤维化的病理生理机制是多因素的，但是HSCs的活化被认为是肝纤维化的关键环节。在肝疾病过程中肝细胞的坏死和凋亡导致炎性细胞的募集，并分泌促纤维化细胞因子，如白细胞介素6(interleukin-6 , IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α , TNF-α)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)等。损伤的肝细胞释放活性氧以及其他的致纤维化物质，同时募集免疫细胞，导致进一步的胶原纤维沉积，激活HSCs促进纤维化的发生发展。近年来的研究已经探索出HSCs激活的多种信号通路，如 TGF-β/Smad、Hh、Wnt/β-catenin、NF-κB和Notch等[4]。

在正常肝中，HSCs是静止的，位于Disse空间，胞体中富含脂滴，当肝受损时，静止的HSCs被激活，然后转化为肌成纤维细胞，分泌大量的ECM[5]。ECM是一种三维的非细胞结构，存在于所有组织中[6]。此时ECM的成分和密度发生改变，生成增加了6～8倍，但是分解并没有相应的增加，导致其过度沉积，同时IV型胶原被I型和Ⅲ型胶原取代。乙型肝炎病毒通过TGF-β1，以Smad2/Smad3依赖的方式驱动HSCs激活[7]。瘦素、IL-6和IL-17通过JAK-STAT3信号途径诱导I型胶原转录。此外，结缔组织生长因子和IL-13通过TGF-β1非依赖性途径促进活化的HSCsⅠ型胶原的表达。I型胶原纤维的积聚会导致ECM机械僵硬化，从而对流经肝的血管施加压力甚至导致门脉高压，为了缓解低氧和营养匮乏的情况则会出现病理性血管增生[8]。

研究表明，持续性炎症和缺氧是病理性血管生成、血管重塑和肝纤维化的强烈刺激因素[9]。缺氧通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路刺激缺氧诱导因子转录增多以及抑制PPARγ激活HSCs、诱导肝窦毛细血管生成、介导慢性炎症等促进肝纤维化的发展[10]。同时炎症细胞分泌促炎细胞因子和VEGF，也会促进新血管的形成[11-12]。新生血管由于功能不完善，通透性低下，增加无效的病理性代偿，最终病理性血管生成和缺氧可能协同作用破坏正常的组织修复形成恶性循环，从而推动纤维化发展。

2 imDC的诱导及维持

DC少于外周血单核细胞数量的1%，因此从外周血中直接获取DC是困难的。人们多从骨髓或是外周血中获取并使用IL -4和集落刺激因子体外诱导4～10 d左右获得imDCs[13]。DC在体内大部分是呈稳定或未成熟状态，当其遇到病原体时才会成为mDCs。imDCs表面共刺激分子和MHCII分子表达的减少，使Th0不能有效的被刺激，从而诱导免疫反应底下或特异性抗原免疫耐受。在构建的大鼠肝移植模型中，注射供体或受体来源的imDCs，与免疫抑制剂(环孢素A[14]、雷帕霉素[15]等)相比较，可以发现imDCs组肝组织汇管区炎性细胞浸润少，肝小叶也没有明显的破坏，急性排斥反应较轻，移植肝存活时间更长[16]。

在自身免疫性疾病中，imDCs也能够起到一定程度的作用。有实验表明，对SLE大鼠注入供体或受体来源的imDCs，可明显的降低尿蛋白，ANA，抗dsDNA抗体和IL-17水平[17]。在MS及EAE动物模型中，imDCs在中枢神经系统中能够促进FoxP3+Tregs增殖，在外周可以通过促进FoxP3、IL-10、 Tregs的分化，包括产生IL-27来加强免疫调节[18]。小鼠克罗恩病主要是以Th1过度活化以及Th17调节失衡所导致的一种自身免疫性疾病，imDCs的注入促进Tregs 的增殖，增加IL-10和TGF-β分泌，抑制T细胞增殖，减缓炎症反应，起到调节免疫功能的作用[19]。

以上的实验都无法维持移植物的功能以及宿主长期存活。可能的原因是imDCs在宿主体内受到宿主自身抗原和炎性细胞的刺激转化为mDCs，因此丧失了调节免疫耐受的能力。因此单纯的输入imDCs只能延缓排斥反应，但无法完全避免。因此药物处理或基因修饰以创造耐受树突状细胞用以免疫治疗成为新的研究热点。通过病毒将dnIKK2、Gal-1转染至imDCs[20-21]，或将锌指蛋白A20从小鼠门静脉注入[22]，都可以抑制DC 核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的表达，通过转录激活因子3(Signal Transducer And Activator Of Transcription 3 , STAT3)通路诱导DC为imDCs并在体内维持。有研究转染了IL-10、 TGF-β[23-24]、FasL 、FoxP3至imDCs[25]，均能使imDCs维持未成熟的状态。 紫外线照射imDC诱导其凋亡并注入小鼠体内，结果表明受体小鼠对供体小鼠的抗原产生了完全彻底的免疫耐受[26]。上述实验不仅能够诱导imDCs在受者体内维持未成熟状态，而且与单纯注入imDCs相比，处理后的imDCs组CD4/8+T淋巴细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)募集减少，IL-12、NF-κB+分泌减少，IL-10、Tregs 分泌增多，这一步的实现使得今后用imDCs无论是进行体外还是体内研究都更具有现实意义。

3 imDC抑制肝纤维化

到目前为止，还没有特异性的药物能够治愈肝纤维化。研究发现去除致纤维化因素后，ECM被降解，肝组织结构能够有所恢复，因此在肝纤维化阶段进行治疗，防止疾病的发展是非常重要的。imDC具备下面几项特点：①强大的吞噬能力，能够摄取加工抗原。②表达少量共刺激分子(如CD80、CD86、CCR7等)，MHCII类分子[27]。③表面具有较少树突样突起。④黏附能力强，移动性弱。因而imDC具有致耐受功能，参加中枢和外周免疫耐受的形成以及持续免疫反应的调节[28]。近年来DC在肝纤维化双向作用的调节上，科研人员进行了大量的研究，针对imDCs抑制肝纤维化的作用上更是着重进行了研究，见图1。

图 1 imDC抑制肝纤维化的相关机制

3.1imDC通过调节肝微环境抑制肝纤维化肝位于胃肠道的下游，暴露于众多的病原体中，但不会引起炎症反应，是由于肝具有独特的微环境。肝纤维化的早期是由于各种病原体的入侵引起了肝的慢性炎症。效应 TH17 细胞增殖会导致组织炎症和自身免疫性疾病。TH17可以通过分泌IL-17作用于枯否细胞，促使其分泌IL-6、IL-1β、TNF-α和TGF-β等炎性因子，增加炎症水平。还可以直接刺激HSCs高表达Ⅰ型胶原，加重肝纤维化。imDCs通过分泌IL-27，抑制微环境中IL-6的产生降低细胞外ATP水平，减少核酸依赖性的炎症，抑制Th17分化增殖，同时促进Tregs 的产生[25]。imDCs表面高表达的FasL和TRAIL也可以直接诱导Th17的凋亡[29-30]。

Tregs是CD4+T细胞群中的一个子集，通过与免疫细胞接触分泌TGF-β、IL-10和IL-35等细胞因子，抑制效应T 细胞应答，发挥免疫调节功能[31-32]。尽管Tregs 具有刺激imDCs分泌TGF-β分泌的作用，但并不被认为是促纤维化的细胞，反而Tregs具有抑制肝纤维化的作用[33]。Tregs可通过分泌IL-10或直接作用抑制CD8+T细胞和TH17来抑制纤维化时期的炎症，Tregs也能以剂量依赖的方式直接抑制HSCs的激活。在非酒精性脂肪肝炎小鼠模型中Tregs 的存在，会使肝中的脂肪堆积减少，炎症水平降低，改善因代谢和炎症方面所产生的问题[34]。相关科研人员已经证实IL-10基因修饰的imDCs通过诱导Tregs ，抑制TGF-β/Smad信号通路减轻小鼠肝纤维化[35]。来自于imDCs的TGF-β、IL-10能够刺激Tregs 增殖， Tregs也会分泌大量TGF-β、IL-10来维持DC的未成熟状态，因此形成了一个循环，两者相互促进[36]。除此之外imDCs产生的TGF-β上调foxp3在Th0细胞中的表达，从而促使Th0向Tregs分化[37]。imDCs还可以直接促进Scurfin蛋白(Foxp3转录因子表达的特异性蛋白)的合成，使Tregs 增殖。

表达于CD4/8+T细胞表面的协同刺激分子与抗原提呈细胞表面表达的协同刺激分子相互作用构成了T细胞活化的第二信号，其中最重要的是B7-CD28。imDC通过表面的B7与活化的T细胞表面CTLA-4相结合，介导T细胞的内吞和降解，并且已经有实验证明T细胞表面CD28的缺失能够降低脂肪性肝炎的炎症水平，缓解肝脂肪变性，减缓肝纤维化的进展[38]。因此imDC能够通过抑制T细胞激活，降低肝炎症水平达到抑制肝纤维化的作用。

3.2减少细胞外基质的产生HSCs的活化被认为是肝纤维化的关键环节，激活后的HSCs转化为肌成纤维细胞，分泌大量的ECM，在肝脏中累积，发展为肝纤维化。INF-γ能够以STAT1依赖的方式增加Smad7蛋白的表达，降低Smad2/Smad3的表达抑制TGF-β诱导的HSCs的激活也可以直接诱导HSCs凋亡。imDCs通过接触激活NK细胞，使其表面高表达TRAIL和 INF-γ,诱导 HSCs的凋亡[39]，也可以直接产生IFN-γ[40]，使活化的HSCs凋亡，并促进巨噬细胞向M1型分化。M1型巨噬细胞高表达CCL2和CCL3作用于NK细胞，促使 HSCs的凋亡，通过分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase , MMP)和肝细胞生长因子促进胶原降解和肝细胞增殖[41]。巨噬细胞也能够募集imDCs并促进它释放IFN-γ[42]，形成一个正反馈，从而抑制肝纤维化。IL-10是一种抗炎细胞因子，可控制中性粒细胞浸润并抑制各种促炎介质，imDCs能够产生大量的IL-10[43]。IL-10处理HSCs可促进STAT3的磷酸化和易位， SA-β-gal活性和衰老标记蛋白p53和p21表达增多，使HSCs的细胞周期阻滞和衰老[44]。由此我们可以推测imDCs能够通过分泌IL-10作用于活化的HSCs上，促使其凋亡，从而达到抑制肝纤维化的作用。imDC表面高表达的FasL和TRAIL可以直接刺激上调HSCs促凋亡蛋白(p53，bax等)的表达，促进 HSCs的凋亡[35]。上述实验从不同的方面证明了imDCs可以抑制HSCs的激活，为今后治疗肝纤维化提供了新思路。

3.3增加细胞外基质的降解肝纤维化最大的特质是ECM产生增多以及降解减少[45]，其中最丰富的分子是Ⅰ和Ⅲ型胶原，而MMPs能够降解ECM中的各种蛋白[46]，从而抑制纤维化。有研究证实imDCs细胞膜中存在2种分子量的MMP9，分别为92000和83000，同时 imDCs也可以直接分泌MMP-9，降解肝中过度沉积的ECM[47]。imDCs还可以通过刺激巨噬细胞间接分泌MMPs(MMP1， 2、7、9、12和13)，降解复杂的细胞外基质。除此之外imDCs能够产生大量的TGF-β，通过Smad2/3和PI3K/AKT信号通路，上调SNAIL蛋白的表达，诱导M2型巨噬细胞分化，并上调IL-10，下调TNF-α和IL-12[48]。在肺纤维化过程中，TGF-β通过激活ERK1/2信号通路表达MMP9，起到保护的作用[49]。但是TGF-β也能够激活HSCs，使α-SMA和Ⅰ型胶原产生增多，加剧肝纤维化的进展，这两个截然不同的作用可能与肝纤维化进展的不同阶段所产生的TGF-β分子量及激活的不同信号通路相关，值得我们进一步研究确认。从以上的研究中可知imDCs无论是直接还是间接，对ECM的降解都能起到一定的作用。

4 总结与展望

肝作为人体重要的代谢器官，任何因素导致的损伤都会给人们的健康带来巨大影响。肝纤维化是疾病发展的一个中间过渡阶段，幸而纤维化是可逆的，因此在纤维化时期进行干预十分重要。机体任何病变的发生都与免疫系统息息相关，随着研究的深入，我们发现imDCs对肝纤维化有一定的抑制作用。通过基因改造以及药物处理，能够延长imDCs体内维持未成熟的时间，但是还不能永久保持未成熟状态。在相关实验中没有细分imDCs的来源，而是将表面标记物和共刺激分子低水平表达的DC归为imDCs，但是DC的来源有很多种，具体每个子集之间是否有差别没有详细的说明。因此希望围绕这些问题能够进一步研究，为更多的纤维化患者带来的福音。