锌指蛋白基因ZMYM2来源环状RNA hsa_circ_0029625的特征分析和功能预测

林铭珍，周新科，姚文霞，潘劲辉，董志杰，王知源，肖 瑶，黄 伟，梁 敏

0 引 言

环状RNA(Circular RNA，circRNA)是一类通过共价键首尾相接形成的闭环RNA分子，不含有典型线性RNA的5′端帽子和3′端多聚A尾[1]。环状RNA具有高度稳定性、细胞组织特异性表达、物种间高度保守等特征[2-4]。已知circRNA生物学调控功能强大，大部分circRNAs富含稳定的微小RNA(microRNA, miRNA)应答元件，作为一种重要的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)与miRNAs结合，发挥miRNA海绵的作用，一般通过负调控miRNA调节下游靶基因表达水平[5]。除了海绵miRNA功能，circRNA也可以作为RNA 结合蛋白海绵，发挥如招募蛋白质等诸多生物功能[6]。另外，人们最初认为circRNA是非编码RNA，近年来逐渐发现部分circRNAs具有翻译蛋白的潜能[7-8]。环状RNA在真核生物中普遍存在，越来越多的circRNAs在不同生物中被发现得益于高通量测序技术的飞速发展[9-10]，它们以普遍多样化的方式存在于真核生物中，但大部分circRNAs仍未得到充分的研究。

ZMYM2基因编码一种锌指蛋白，主要定位于细胞核[11]。作为一种核锌指蛋白，ZMYM2富含一系列典型的蛋白质-蛋白质相互作用的锌指结构域，研究证明该串联锌指区域广泛地参与从DNA损伤反应到mRNA剪接等过程的蛋白质相互作用[12]，其中较为重要的是驱动ZMYM2与组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)特异结合，形成染色质上的核心转录辅阻遏子复合体，发挥转录抑制作用[13-14]。ZMYM2具有与类泛素修饰物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)修饰的蛋白结合的活性，可介导上述转录辅阻遏子复合体锚定到染色质上[15]。同时，作为人类胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)中最具生长限制性的染色质相关基因，ZMYM2在体外具有促进人ESCs多能性功能退出，促进早期分化的作用，且其表达在早期分化是必需的[16]。反过来，利用这一点，推测可以通过敲除ZMYM2来增强体细胞向多能干细胞诱导的重编程能力[17]。更重要的是，ZMYM2对体内ESC来源的畸胎瘤的形成是必不可少的，在ZMYM2突变体中，最主要的表型是不能产生成熟的畸胎瘤[16]。在肾发育中，先天性肾和尿路发育异常是最常见的出生缺陷之一，ZMYM2的功能缺失型突变与之有密切联系。利用对ZMYM2突变体的研究，Dervla等[11]证实了ZMYM2在肾和颅面发育中起关键作用。此外，ZMYM2与血液系统疾病也密切相关，它与成纤维细胞生长因子受体1基因(Fibroblast Growth Factor Receptor 1genes，FGFR1)相互易位后形成的ZMYM2-FGFR1融合基因是目前淋巴母细胞瘤中研究最多的基因。ZMYM2 与FGFR1融合产生一种结构性活性的胞浆酪氨酸激酶，通过调控增殖凋亡过程，导致细胞恶性转化[18]，提示与肿瘤发生发展较大的相关性。

综上所述，ZMYM2涉及人体多个生理过程及系统疾病，是一个值得深入探究的基因分子。根据circBase收录信息，ZMYM2可通过反向剪接产生60个环状RNA，我们从样本分布较为广泛，在小鼠物种里具有同源保守特性的，同时评分较高的环状RNA中重点关注到hsa_circ_0029625，从其反向剪接位点及全长测序验证、是否耐受RNase R、细胞内表达分布、蛋白翻译潜能四方面探究其基本特征。此外，检测了该circRNA以及相应的部分下游靶基因在胃癌组织中的表达，初步从肿瘤层面探究其功能。通过预测潜在结合的miRNAs 以及相应miRNAs的下游靶基因，构建circRNA-miRNA-mRNA三者的调控网络，对靶基因进行基因本体论(Gene Ontology，GO)注释及功能富集，探究hsa_circ_0029625的潜在生物功能，同时筛选下游胃癌关键基因，更深入解释该circRNA与胃癌的关系。本文从环状RNA角度丰富ZMYM2的相关研究，且提供了hsa_circ_0029625的胃癌相关研究思路。

1 材料与方法

1.1 细胞及组织标本HEK293T(人胚肾上皮细胞)为美国典型培养物保藏中心来源；胃癌组织标本来自广州医科大学附属第五医院普外科胃癌患者，纳入标准：经由两位病理医师独立确定的临床病理特征明确的胃癌患者(根据the Union for International Cancer Control的准则)，排除标准：排除手术前接受放化疗处理的胃癌患者。本项研究通过了广州医科大学附属第五医院的伦理委员会(伦理委员会批号：KY01-2020-11-04)。

1.2实验试剂TRIzol试剂、引物购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(RR820A)、LA Taq (RR02MQ)、RNase-free H2O购自Takara公司，DMEM细胞培养基、双抗、胎牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司，磷酸缓冲液PBS购自Hyclone公司，DNA marker(M10-02，Omega公司)，DNA loading buffer(Takara公司)，RNeasy MinElute Cleanup Kit(74204，Qiagen公司)，PARIS Kit(AM1921，生命技术公司)，RNase R(Epicentre，RNR07250，ILLUMINA公司)。

1.3hsa_circ_0029625反向剪接位点和全长的PCR扩增及Sanger测序鉴定依据circBase(http://www.circbase.org/)上hsa_circ_0029625序列信息设计一对可扩增出反向剪接位点的双向引物[19]，引物序列为：Forward Primer gtgtcagtgaatacaaacaggttc ；Reverse Primeragacactaaaggattagctggac ，以及两对全长扩增双向引物，两对引物序列分别为：Forward Primeracaccccatctttaacttcacagacca；Reverse Primergaacctgtttgtattcactgacacaac。Forward Primer gttgtgtcagtgaatacaaacaggttc；Reverse Primer ctgggagatccaagaatcaggattatg。利用细胞的cDNA模板进行PCR扩增，其中，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 试剂盒来进行剪接位点的PCR扩增，反应体系：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，正反向引物各0.8 μL，去RNase 酶水 6 μL，cDNA 2 μL。预期引物可以扩增出大小为162bp的条带。全长序列的PCR扩增是通过LA Taq试剂盒进行，反应体系如下：LA Taq 0.5 μL，10x LA Taq Buffer II 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，cDNA 5 μL，正方向引物各5 μL，灭菌水21.5 μL。PCR产物经1.0%琼脂糖核酸凝胶电泳后，送艾基生物技术有限公司进行Sanger测序。

1.4RNase R处理实验

1.4.1 RNA提取用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞并收集，提取细胞的总RNA。

1.4.2RNaseR处理RNA样品分成两组，分别是RNase R组和对照组(各10 μg RNA)，RNase R组加入20 U(2 U/μg)的RNase R试剂，对照组加入等量的RNase-free H2O，在37 ℃条件下孵育10 min。

1.4.3RNA纯化根据RNeasy MinElute Cleanup Kit试剂盒说明书对上述处理后的RNA样品进行纯化，分别检测两组RNA浓度。

1.4.4逆转录实时定量PCR分别取1μg的RNase R组和对照组RNA样品用反转录试剂盒进行反转录，得到的cDNA产物通过TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 试剂盒进行PCR扩增，反应体系如下：去RNase水 6 μL，TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL。根据反应后样本的Ct值，用2-ΔΔCt算法得到RNA表达量。

1.5hsa_circ_0029625的胞内表达分析实验

1.5.1 细胞质核RNA分离及提取用冷的TRIzol裂解液制备细胞裂解物，根据PARISTMKit试剂盒说明书进行细胞质核分离并提取，其中RNA 结合玻璃纤维过滤柱从混合物中纯化总 RNA，分别测定胞质和胞核RNA的浓度。

1.5.2逆转录实时定量PCR各取细胞质和细胞核RNA样品500 ng进行反转录，所用试剂盒同1.3.4。接着进行实时定量PCR检测胞质胞核RNA的表达量，具体反应体系和反应条件同1.4.4。

1.6翻译蛋白潜能及分析通过circRNADb(http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)数据库数据预测hsa_circ_0029625蛋白翻译潜能[20]，绘制该翻译蛋白的形成示意图，并将其翻译蛋白序列与ZMYM2蛋白进行比对，绘制ZMYM2蛋白结构域示意图及潜在蛋白比对示意图。

1.7胃癌组织RNA定量分析

1.7.1 胃癌组织RNA提取将实验用镊子、刀片、刀柄、研磨棒进行高压灭菌处理后置于烘干箱内180 ℃高温烘烤4 h，以除去RNA酶。根据组织RNA提取试剂盒plus(上海奕杉，RN002plus)说明进行RNA提取，整个过程在4 ℃下进行。

1.7.2逆转录实时定量PCR取1 μg组织样本RNA参照反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraserx说明进行反转录，以反转录后的cDNA为模板，根据上述扩增hsa_circ_0029625剪接位点双向引物进行实时定量PCR实验，具体反应体系和反应条件同1.4.4。根据反应后样本的Ct值，用2-ΔΔCt算法得到环状RNA表达量并用Cytoscape软件作图分析。

1.8CircRNA-miRNA-mRNA网络的构建以及下游关键基因与胃癌预后关系分析

1.8.1 circRNA-miRNA-mRNA网络的构建根据CSCD (http://gb.whu.edu.cn/CSCD/)和circInteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)这两个数据库预测环状RNA hsa_circ_0029625上潜在结合的miRNA[21-22]，取预测结果的交集作为该环状RNA最可能结合的miRNA。接着利用miWalk数据库12种算法(miRWalk、Microt4、miRanda、mirbridge、miRDB、miRMap、miRNAMap、Pictar2、PITA、RNA22、RNAhybrid、Targetscan)预测miRNA下游靶基因[23]，本研究选择将miWalk数据库中至少9种算法都预测到的miRNA的靶基因去除重复基因后作为主要研究对象。通过随机数生成选择后续研究的靶基因，并使用Cytoscape 3.8.2软件将circRNA-miRNA-mRNA网络可视化[24]。

1.8.2下游关键基因筛选利用STRING11.0在线数据库得到下游靶基因的蛋白互作网络，去除未连接的靶基因，借助Cytoscape 3.8.2软件中的MCODE算法进行筛选关键基因，选择K-score为2，在得到的子网络中锚定与胃癌较为相关且分数值最高的基因相互作用簇作为展示。

1.8.3关键基因与胃癌预后分析通过Ualcan在线数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)进行关键基因与胃癌预后的分析。

1.9GO的功能注释通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对预测的miRNA靶基因进行GO分析[25]，从生物学过程(biological process，BP)和分子功能(molecular function，MF)两方面对靶基因进行功能富集。

2 结 果

2.1 hsa_circ_0029625反向剪接位点及全长序列的验证PCR扩增产物的琼脂糖核酸凝胶电泳成功得到大小为162 bp 的包含反向剪接位点的扩增片段，见图1a。circBase注释信息显示hsa_circ_0029625是由ZMYM2基因转录本NM_003453的第6号外显子反向剪接至第3号外显子而形成，属于外显子环化形成的环状RNA，箭头表示第6号外显子末端序列与第3号外显子的起始序列结合处，Sanger测序峰图结果验证反向剪接位点的序列，证明该环状RNA可正确成环,见图1b。同时，设计两对引物通过PCR扩增全长序列,并送测序，测序序列结果与circBase注释信息里hsa_circ_0029625序列比对，比对结果一致，符合预期，见图2。

a：PCR扩增验证； b：成环图及测序峰图

a：PCR扩增全长模式图；b:测序结果比对图

2.2hsa_circ_0029625的RNase R 耐受性及细胞内表达情况环状RNA hsa_circ_0029625和CDR1as 的RNase R组和对照组相比表达量差异无统计学意义(P>0.05)，而GAPDH(线性RNA)RNase R组与对照组相比表达量明显下降(P<0.05)，说明hsa_circ_0029625可耐受RNase R消化，见图3。在鉴定细胞定位的实验中，已知CDR1as主要表达于细胞质，hsa_circ_0029625和CDR1as在细胞质的表达量均显著高于细胞核，其中hsa_circ_0029625在细胞质表达量约为细胞核的14倍，说明该环状RNA主要分布于细胞质。

与对照组比较，*P<0.05

2.3hsa_circ_0029625的翻译蛋白潜能及蛋白潜在结构域分析hsa_circ_0029625潜在翻译蛋白包含两段IRES，起始和终止位点分别为1416-1517、871-966，提示hsa_circ_0029625具有翻译蛋白潜能。同时，hsa_circ_0029625具有一个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其蛋白质翻译起始位点为第1470位核苷酸，终止位点位于绕环两周后的第48个核苷酸(2r+48)，预测可编码一条540个氨基酸的多肽。见图4。将hsa_circ_0029625可能翻译的氨基酸序列与ZMYM2氨基酸序列进行比对，发现hsa_circ_0029625潜在翻译蛋白的aa22到aa529与ZMYM2蛋白的aa1到aa508高度同源，可能包含了ZMYM2相应结构域，见图5。

2.4胃癌组织样本中hsa_circ_0029625差异表达通过荧光定量PCR实验对hsa_circ_0029625的表达量进行检测，相比较癌旁组织，hsa_circ_0029625在胃癌组织中表达量显著下调。见图6。

图 4 hsa_circ_0029625的蛋白翻译示意图

图 5 ZMYM2蛋白结构域示意图与hsa_circ_0029625潜在结构域示意图

1#-6#:胃癌/癌旁组织标本

2.5hsa_circ_0029625作为mi RNA海绵的潜在能力根据CircInteractome和CSCD数据做出hsa_circ_0029625的miRNA结合位点的模式图，如图7。CircInteractome上数据显示miRNA结合位点数量为73个，包含62种miRNA。CSCD上数据显示hsa_circ_0029625上miRNA的结合位点数量为68个，包含 67 种miRNA。取两个数据库交集的3个miRNA(hsa-miR-1231、 hsa-miR-579-3p、 hsa-miR-659-3p)作为该环状RNA最可能结合的miRNA进行下一步靶基因功能探究。

2.6CircRNA-miRNA-mRNA调控网络和下游关键基因筛选及与胃癌预后关系分析构建了以hsa_circ_0029625、hsa-miR-1231、hsa-miR-579-3p、hsa-miR-659-3p以及56个mRNAs为核心的circRNA-miRNA-mRNA分子调控网络图,如图8a。hsa_circ_0029625可能通过海绵上述3个miRNA调控这些下游靶基因，分别为：RIMBP2、ARSB、CHMHL、MARCKS、POU4F1、SLC1A2、SLC1A3、USH2A、ZFX、DGKE、STAG2、RNF11、ATP2C1、DENND4C、CRISPLD1、KIAA1804、LYRM7、TMEM213、CHSY3、SH2D4B、VGLL3、FAM46A；FOXP1、TPM3、MBP、NRAS、SLCO1A2、HLTF、LHFPL2、MGEA5、NFAT5、TRAM1、SMUG1、TLR7、GPR88、TNFRSF19、CGN、KLHL42、KATNBL1、CNOT6L；KCNA1、PNN、ONECUT2、CELF4、LTBP2、OAS3、PIK3R1、NR2E1、WIPF1、GPR55、PLEKHM1、TMEM115、GPR124、RNF125、PHF13。利用STRING11.0在线数据库和Cytoscape 3.8.2软件筛选得到该circRNA下游靶基因的14个蛋白互作网络，由于实验中发现hsa_circ_0029625在胃癌样本中普遍表达下调，这种差异表达提示其作为胃癌生物标志物的潜在可能性，为了进一步探究其下游靶基因与胃癌的联系，锚定与胃癌较为相关的且分数值(4.0)最高的基因相互作用簇，确定SOST，SFRP1，LRP6，RUNX2这4个关键基因的相互作用簇作为展示，见图8b。此外，借助Ualcan在线数据库上的数据挖掘发现，RUNX2、SFRP1的高表达与胃癌患者预后相关(P<0.05)，见图9。高表达RUNX2、SFRP1患者的生存曲线与低表达患者的生存曲线具有显著差异，高表达RUNX2、SFRP1患者患者预后较差。这提示，hsa_circ_0029625可能通过上述3个miRNAs靶向调控下游4个关键基因上调促进胃癌发展，与胃癌预后密切相关。

2.7hsa_circ_0029625潜在下游靶基因在胃癌中的初步验证为初步验证hsa_circ_0029625潜在作用的下游靶基因，从预测的hsa_circ_0029625下游靶基因中随机选择部分基因，研究其在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况，如图10。荧光定量PCR实验结果提示5个潜在下游靶基因(ANGPT1,CYBRD1,TOX,KLF9,PRKAR2B)在6例胃癌组织较癌旁组织表达下调，尽管5个基因表达在不同例胃癌/癌旁组织中表达具有个体差异性，但KLF9在大部分胃癌组织中表达较癌旁组织显著下调。另外，CYBRD1、TOX和KLF9这3个潜在下游基因在部分胃癌组织中几乎不表达，而在对应的癌旁组织明显表达。

图 7 hsa_circ_0029625的结构及其miRNA应答原件结合位点示意图

a: hsa_circ_0029625的circRNA-miRNA-mRNA调控网络图；b:下游关键基因蛋白互作图

2.8靶基因合集的GO功能富集对上述预测的下游靶基因进行GO功能富集，结果显示靶基因在BP方面有13个条目中富集，其中最显著富集的条目分别为：转录、参与分化的细胞形态发生、细胞成分形态发生。在MF方面，靶基因在9个条目中富集，其中最显著富集的条目分别为：转录调节活性、转录阻遏物活性、特异性DNA序列结合，见图11。

图 9 关键基因对胃癌患者预后的影响

1#-6#:6例胃癌/癌旁组织标本

a：生物过程；b ：分子功能

3 讨 论

环状RNA数量庞大且种类丰富，是RNA家族中研究较为热门的成员。在ZMYM2编码的众多环状RNA(circBase数据库收录60个)选择了样本分布广泛、在小鼠物种里具有同源保守特性、评分较高的剪接长度为1522bp的环状RNA hsa_circ_0029625。Hsa_circ_0029625是由ZMYM2基因转录本 NM_003453 的4个外显子(exon3、exon4、exon5、exon6)反向剪接而成，通过PCR扩增、Sanger测序成功验证其反向剪接位点及全长序列，其剪接前后的序列分别是AG和GT,符合环状RNA产生的剪接规律[28]。在RNase R处理实验中，hsa_circ_0029625具有环状RNA的耐受RNase R消化的基本特征，可正确成环。同大多数circRNA一样，hsa_circ_0029625主要分布于细胞质中，为其充当位于胞质的miRNA海绵提供更大可能。

人类ZMYM2基因位于13号染色体的q12位置，其转录本NM_003453一共由1号到25号外显子组成，编码一种含有1377个氨基酸的分子质量为150 kDa的锌指蛋白，主要位于细胞核[29]。目前研究发现该锌指蛋白包含3个类泛素化蛋白相互作用基序(SUMO-interacting motifs，SIMS)[30]、9个重复的锌指基序、1 个富含脯氨酸-缬氨酸的结构域和2个潜在核定位区域[31](结构示意图见图5)。3个SIM分别对应蛋白质中的aa55-68、aa111-124、aa477-491，其中有两个位于蛋白的N端，另一个与锌指基序部分重合，多个SIMs可以介导ZMYM2蛋白与多个类泛素修饰物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)相结合，提供招募蛋白质的平台，对ZMYM2形成转录辅阻遏复合体且锚定到染色质上具有重要性[13,15]。串联锌指基序结构域是由含34～58个氨基酸的九个重复单元形成的约含有430个氨基酸的结构域，该区域被证明可以驱动ZMYM2与SUMO化的HDAC1特异结合且相互作用，后者是转录阻遏复合体成分之一[32]。除了SIMS外，锌指区域还被发现包含SUMO结合区域，推测ZMYM2可能也是一种SUMO化蛋白[33-34]。ZMYM2基因和FGFR1基因融合导致骨髓增生性疾病，其富脯氨酸-缬氨酸结构域诱导FGFRl的酪氨酸残基磷酸化，从而激活酪氨酸激酶活性，进一步激活下游导致细胞恶性增殖的多条信号转导途径。ZMYM2的C端包含两个核定位结构域(nuclear locali-zation signal，NLS)，可能介导该锌指蛋白的核定位，另外，NLS丢失很可能是ZMYM2/FGFR1融合激酶的细胞质定位的原因[33]。来源于ZMYM2基因的hsa_circ_0029625具有两个IRES元件和一个开放阅读框，可能具有翻译蛋白的特性，本研究利用circRNADb上hsa_circ_0029625的潜在翻译蛋白序列与ZMYM2蛋白序列比对发现，该潜在翻译蛋白序列对应ZMYM2蛋白质中的aa1～508,结构域方面包含3个SIMs区域以及部分串联锌指基序(前3个)和中间的连接区域，提示hsa_circ_0029625翻译的蛋白具有SIMs和部分串联锌指基序(前3个)和中间的连接区域的功能。但是，关于hsa_circ_0029625翻译蛋白的能力以及是否具有ZMYM2蛋白相似功能甚至其他功能仍需进一步探究。

circRNA具备海绵miRNA的能力，是一种极为重要的 ceRNA，本研究通过circInteractome和CSCD数据库多种算法综合预测hsa_circ_0029625具有多个潜在结合 miRNAs，通过两个数据库交集筛选出最可能的3个潜在结合miRNA，分别是hsa-miR-659-3p 、hsa-miR-579-3p、hsa-miR-1231。作为一种circRNA,除了翻译蛋白功能，我们猜测hsa_circ_0029625可能通过海绵作用竞争结合并抑制miRNA发挥功能，进而促进下游靶基因的表达及相应信号通路发生。关于ZMYM2的功能，目前暂时发现其在转录抑制[7,15]、沉默内源性逆转录病毒序列[1]、核糖体 RNA 转录[18]、调节原始幼稚细胞多能性方面[16]、泌尿系统发育[11]骨髓增殖性疾病[33-34]具有重要功能。我们对来源于ZMYM2的hsa_circ_0029625调控的下游靶基因GO功能注释显示，其调控的生物学过程和功能多富集于转录调控、参与分化的细胞形态学发生、蛋白质结合定位和功能发挥以及泌尿生殖系统的发展等，推测环状RNA hsa_circ_0029625 翻译蛋白可能有与ZMYM2蛋白有较为相似的功能，可能通过海绵miRNA调控下游靶基因发挥上述某些功能。

同时，本研究发现has_circ_0029625在6个胃癌组织样本表达显著下调，提示该circRNA与胃癌发生发展可能有密切关系，尽管在肿瘤组织异常表达的circRNA中上调的circRNA获得较大关注，但一些下调的circRNAs如circYAP1，circFAT1(e2)，circMTO1， Hsa_circ_0065149等被证明与胃癌发生发展密切相关[35-38]。其中circYAP1, Hsa_circ_0065149与胃癌肿瘤大小,预后显著相关。circMTO1在胃癌组织低表达，研究发现其通过miR-199a-3p/PAWR轴调控胃癌的发生发展。此外，过表达circMTO1，circFAT1(e2)证明可以抑制肿瘤生长，减少细胞侵袭和迁移。目前关于环状RNA对胃癌细胞增殖凋亡，迁移侵袭及胃癌发展、预后中的调控作用被大量研究[39-40], 但环状RNA与胃癌发展，诊疗，预后三者的具体联系仍有待完全阐明，本实验发现了新的与胃癌潜在相关的circRNA，其在胃癌组织中表达显著下调，且其下游胃癌相关靶基因RUNX2与胃癌患者预后密切相关[26]。过表达该环状RNA能否抑制胃癌发展及其能否作为胃癌预后预测潜在靶点需要更多样本数据及实验进一步探究及证实。此外，成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFRs)家族与肿瘤发生发展密切联系，被认为参与癌细胞的增殖分化以及迁移过程, 其中，前述的ZMYM2与FGFR1形成的融合蛋白在骨髓增殖性肿瘤中发挥促进细胞恶性转化的作用。Has_circ_0029625潜在编码蛋白是否通过融合蛋白的形式还是其他方式发挥促癌作用，有待进一步探究。此外，我们筛选出4个下游关键基因，其中有2个基因RUNX2、SFRP1促进胃癌发生和迁移的功能被大量研究，我们猜测has_circ_0029625也许存在circRNA-miRNA-mRNA通路调控胃癌的发生和进展。更进一步的数据分析显示2个促胃癌关键基因的高表达与胃癌预后密切相关，提供了一个探究has_circ_0029625与胃癌预后关系的研究思路。我们在胃癌组织中初步验证了has_circ_0029625的5个潜在下游靶基因，hsa_circ_0029625在6例胃癌组织中的表达也是下调的，hsa_circ_0029625与5个潜在下游靶基因在胃癌组织中表达的一致性提示它们在功能上的相关性，初步确定hsa_circ_0029625可能调控的下游靶基因。其中KLF9在胃癌组织中下调较为显著，有研究发现KLF9通过调控MMP28转录来抑制胃癌细胞的侵袭和转移，具有远处转移的胃癌患者KLF9表达显著下调，这与我们的研究结果一致，提示KLF9在胃癌中与患者预后密切相关[41]。

关于ZMYM2来源的circRNA研究尚较少，目前仅报道发现来源于ZMYM2基因的另外一个circRNA(hsa_circ_0099999)可通过作为miR-355-5p海绵来上调下游基因JMJD2C表达，从而促进胰腺癌进展，是一种潜在的肿瘤标志物[42]。本研究对ZMYM2来源的has_circ_0029625进行特征分析，预测其潜在的翻译蛋白功能以及潜在的作为miRNA海绵的相关功能：ZMYM2蛋白上SIMs和部分串联锌指基序以及中间的连接区域的功能、转录调控功能、参与细胞分化的形态学发生功能以及泌尿生殖系统发展的相关功能。胃癌样本结果和数据挖掘分析提供了has_circ_0029625作为胃癌诊疗潜在靶点的研究思路。当然，关于has_circ_0029625的上述功能预测及探究，仍有待相关实验进行完善探索。