外周血IL-17、HMGB1水平诊断不明原因复发性流产价值及其与Th17/Treg细胞关系

储莉鸣 马梓汶* 陈守真

1.上海市浦东新区妇幼保健院(201206)；2.复旦大学附属妇产科医院

目前临床尚有50%的复发性流产(RSA)原因不明，称为不明原因复发性流产(URSA)。诸多研究认为RSA与妊娠早期母体免疫反应相关，辅助性细胞Th17与调节细胞Treg的相互作用导致母体对胎儿发生免疫耐受与排斥反应失衡是导致USAR的主要机制[1-2]。外周血高迁移率族蛋白B 1(HMGBl)具有较强致炎作用。参与机体炎性发生发展，不仅可刺激机体免疫系统，促使炎性因子分泌且能通过促进炎性细胞成熟使患者炎性反应加重[3]。白细胞介素-17(IL-17)也是早期炎症反应的启动因子，可通过释放前炎性细胞因子来加重炎性反应[4]。研究表明[5]：因炎性因子水平升高引发的母体细胞因子改变与URSA发生有一定相关性。基于此，本研究探究外周血IL-17、HMGB1水平与Th17/Treg细胞的关系。以期为临床规范提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取2019年3月-2020年3月本院就诊的URSA孕妇为URSA组。纳入标准，①经诊断确诊为URSA，流产≥3次；②未发现明确流产病因。排除标准：①合并肿瘤；②免疫疾病；③染色异常、生殖感染；④临床资料不全；⑤既往孕期治疗史。体检健康孕妇60例为对照组。本研究经本院伦理委员会审批，患者均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1仪器试剂流式细胞仪(Attune NxT流式细胞仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)、流式抗体(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)、试剂盒(上海纪宁实业有限公司)、酶标仪(北京普朗新技术有限公司)、离心机(广州吉迪仪器有限公司)。

1.2.2检测患者入院后采集静脉血5ml(健康孕妇于体检当日)，抗凝分液后离心，分离外周单细胞，按1×106制成细胞悬液，铺至培养板，加入10%胎牛血清，与50ng/ml豆蔻酰佛波醇乙酯2.5μl、1ug/ml离子霉素2μl、10ug/ml离子霉素2μl混匀，孵育4h；加入单抗CD420μl孵育20min，最后分别加入2ml染色缓冲液与20μl抗IL-17单抗孵育15min；再次离心10min，使用流式细胞仪检测Th17、Treg细胞，计算比值。血液离心分离血清，酶联免疫吸附试验检测HMGB1、IL-6、IL-10、IL-17、转化生长因子-β(TGF-β)水平。

1.3 观察指标

检测两组HMGBl、Thl7、Treg、Thl7/Treg、IL-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10(interleukin-10，IL-10)、IL-17、TGF-B等指标；分析外周血IL-17、HMGB1水平与Th17/Treg细胞关系，以及IL-17、HMGB1的预测价值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般情况

URSA组60例，年龄(27.4±5.1)岁(21～35岁)，孕周(8.8±1.6)周(6～10周)；对照组60例，年龄(28.0±5.7)岁(21～36岁)，孕周(8.8±1.6)周(6～10周)。两组年龄和孕周无差异(P>0.05)。

2.2 两组外周血免疫指标比较

URSA组Th17细胞、Th17/Treg值高于对照组，Treg细胞低于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组外周血免疫指标比较

2.3 两组炎症因子指标比较

URSA组HMGB1、IL-6、IL-17水平高于对照组，TGF-β、IL-10水平低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组炎症因子指标比较

2.4 IL-17、HMGB1水平与免疫因子相关性

IL-17、HMGB1水平与Th17、Th17/Treg、IL-6正相关，与Treg、TGF-B、IL-10负相关(均P<0.05)。见表3。

表3 IL-17、HMGB1水平与各免疫因子相关性

2.5 IL-17、HMGB1预测URSA价值

ROC曲线分析显示，IL-17、HMGB1水平预测URSA的AUC分别为0.790、0.980，均具有一定价值；以约登指数的最大切点作为最佳临界值，该点预测敏感度、特异度均较高。将IL-17、HMGB1水平纳入logistic回归模型，通过回归系数得出两项联合的数值计算公式=IL-17 +(-0.278)/(-0.103)×HMGB1，得出联合数据。进一步ROC曲线分析显示，两项联合预测敏感度最高。见表4。

表4 IL-17、HMGB1水平诊断URSA价值

3 讨论

母胎界面在正常妊娠情况下存在一定量的免疫细胞，而免疫细胞的正常存在与比例构成免疫耐受，对妊娠正常分娩具有保护作用[6]。在某些病理因素的影响下，例如炎性因子的增加，机体免疫细胞的数量改变、比例失衡，可直接和(间接)损伤机体免疫功能，不仅使患者感染率和免疫疾病的发病率升高，且促使母体对胚胎发生免疫排除反应，最终导致流产，URSA发生[7-8]。

Thl7是Th细胞亚群中的一种，具有强促炎作用，参与免疫疾病与排斥反应的发生发展。Treg是转录因子FOXP3的一种，具有免疫负性调节功能，可在细胞接触与分泌抑制过程发挥抗炎作用，维持自身免疫耐受[9-10]。本研究结果显示，URSA组Th17细胞、Th17/Treg值均高于对照组，Treg细胞低于对照组。可能原因为URSA患者的免疫耐受功能受损，抗炎作用减弱，炎性反应加强，Treg细胞减少，Thl7细胞增多。有研究表明[11]，Treg可通过免疫抑制对母体免疫耐受起到促进作用，Treg数量及功能欠缺会减弱母体免疫耐受维持，导致URSA发生。

IL-17是Thl7的效应因子，具有诱导机制金属蛋白酶、趋化因子表达、中性粒子聚集作用，引发组织浸润与破坏[12]。HMGB1通过参与细胞复制转录重组修复全过程，诱导信号联级反应，放大机体炎症[13]。本研究结果显示，URSA组HMGB1、IL-6、IL-17水平均高于对照组，TGF-B、IL-10水平均低于对照组。可能原因： IL-6、IL-17是Thl7的相关因子，在URSA表达与Thl7具有一致性； IL-10、TGF-β是Treg的相关细胞因子，表达亦具有一致性； IL-17、HMGB是炎性表达因子，URSA时患者免疫抑制细胞减少，炎性放大，IL-17、IL-6、HMGB水平上升，TGF-β、IL-10水平下降。

本研究对IL-17、HMGB1水平与各指标相关性进行分析显示，IL-17、HMGB1水平与Th17、Th17/Treg、IL-6及组别正相关，与Treg、TGF-B、IL-10负相关。提示机体炎性发生、母体界面的免疫失衡与IL-17、HNGBI、TH17/Treg值和IL-6水平异常升高有关。Treg、TGF-B、IL-10下降，进一步反映IL-17、HMGB1与免疫细胞存在关联，参与了Th17与Treg平衡调节与URSA发病过程。可能原因为[14-16]： HMGB1、IL-17通过Th17发挥作用，促进炎性细胞释放，Th17细胞及相关的IL-6、IL-17水平增加； HMGB1、IL-17促使炎性程度加重，通过作用于Treg细胞参与免疫因子调控，使Treg细胞及相关IL-10、TGF-β水平减少；HMGB1、IL-17作用于Th17、Treg细胞，导致Th17与Treg比例失衡。有研究表明[17]，HMGB1表达异常常出现于病理妊娠，高表达的HMGB1与URSA发生关系密切，与本研究结论一致。通过IL-17、HMGB预测URSA具有较好的准确性；从敏感度、特异度来看，IL-17、HMGB预测URSA均有一定价值，而两者联合运用提高了预测敏感度。由于本研究例数较少，两项指标诊断预测效果仍需深入研究，但可看出与URSA发生关联密切，临床可将其作为观察指标，为诊治URSA提供参考依据。

综上所述，URSA患者外周血IL-17、HMGB1水平呈异常高表达，与Th17/Treg细胞呈正相关，临床可将其作为治疗观察指标。