细胞焦亡在中枢神经系统疾病中的研究进展

王成刚，麻彬

(上海市同济医院脊柱外科，上海 200065)

程序性细胞死亡是指正常的机体细胞在受到生理或病理信号后引发的自主性细胞清除过程[1]，在大脑发育、调节内稳态及清除感染细胞等过程中发挥重要作用。目前研究已发现12种程序性细胞死亡机制，从非炎症细胞死亡(如细胞凋亡)到高度促炎细胞死亡(如细胞焦亡、程序性细胞坏死)，每种程序性细胞死亡均有其独特的分子特征[2-3]。细胞焦亡是典型的促炎性程序性细胞死亡，其特征为GSDMD(Gasdermin D)蛋白分子在细胞膜上形成孔洞，导致细胞裂解死亡，释放炎症因子。中枢神经系统疾病的发生发展由多种机制共同作用，随着深入研究发现，细胞焦亡与中枢神经系统疾病密切相关，涉及多发性硬化症、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)及创伤性脑损伤等[3-4]。了解细胞焦亡在中枢神经系统疾病中的作用机制可能为防止疾病发展提供新的方向。现对细胞焦亡的分子机制及其在中枢神经系统中的作用机制予以综述。

1 细胞焦亡的分子机制

细胞焦亡是2002年首次在弗氏志贺杆菌感染的巨噬细胞中发现的一种新型程序性细胞死亡[4]。其特征是在细胞膜上形成10～15 nm孔洞，破坏膜的完整性，导致细胞内炎症因子释放，促进炎症形成[5]。目前研究认为，细胞焦亡的激活需要依赖胱天蛋白酶(caspase)(人类caspase-1/4/5和小鼠caspase-1/11)[6-7]，根据蛋白酶的类型将细胞焦亡途径分为由caspase-1介导的经典细胞焦亡途径和由caspase-4/5/11介导的非经典细胞焦亡途径[8]。

在经典途径中，炎症小体的组装是细胞发生焦亡的关键步骤[9]。炎症小体由3个部分组成，包括模式识别受体、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1。模式识别受体是炎症小体的感受器，用于识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，目前已发现多种模式识别受体[10]；①Toll样跨膜受体，受体的胞外部分负责识别病原体相关分子模式，胞内部分负责转导信号；②视黄酸诱导基因-I样受体，含有解旋酶结构，负责识别病毒结构；③核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)，包括NLR受体蛋白(NLR receptor protein，NLRP)1、NLRP2和NLRP3，为细胞内结构，负责识别细胞内的DAMPs；④C型凝集素样受体，配体分子为真菌细胞壁的甘露糖和β-葡聚糖,主要负责识别真菌。一旦这些炎性感受器被激活，将招募ASC和caspase-1前体。ASC是一种由PYCARD基因编码的非酶支架蛋白，形成炎症小体的骨架，将感受器与效应蛋白酶配对，并促进caspase-1前体向caspase-1转化，使其具有水解活性[11]。当炎症小体组装完成后，活化的caspase-1将GSDMD蛋白裂解，释放具有脂溶性的N端亚基，导致细胞膜上形成孔洞，介导细胞裂解；此外，活化的caspase-1作用于白细胞介素(interleukin,IL)-1和IL-18前体，形成有活性的IL-1β和IL-18，通过细胞膜孔洞释放到细胞外，诱发炎症，具体途径见图1。有研究显示，caspase-1活化的结果并非都是细胞裂解和释放炎症因子同时发生，也可以单独出现[12-13]。另有研究发现，当胞内炎症小体的组装成分(如NLRP3和ASC)处于高水平表达时，细胞焦亡能在模式识别受体尚未被激活的状态下发生[14]。

非典型途径需要人类caspase-4/5或小鼠caspase-11的前体直接通过结合脂多糖来激活。活化的caspase-4通过裂解GSDMD蛋白，导致细胞膜孔洞形成，诱发细胞焦亡。尽管caspase-4/11对底物的选择更受限，但对GSDMD蛋白的亲和力没有改变[15]。目前发现，典型途径与非典型途径之间可以发生串扰。例如，在非典型志贺毒素/脂多糖非典型途径中，裂解的GSDMD蛋白在线粒体中富集，导致线粒体内活性氧的产生，随后激活典型途径的NLRP3炎症小体[16]。这些研究表明，非典型途径介导的GSDMD蛋白激活与典型途径炎症小体的部分激活和细胞因子的释放可通过细胞内的DAMPs产生相互联系，但具体机制有待探究。

注：IL为白细胞介素，Activated caspase为活化的胱天蛋白酶，ASC为凋亡相关斑点样蛋白，PRRs为模式识别受体，PAMPs为病原体相关分子模式，DAMPs为损伤相关分子模式，LPS为脂多糖

2 细胞焦亡与细胞类型

中枢神经系统存在多种细胞类型，包括神经元、脑巨噬细胞样细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞。研究显示，在中枢神经系统疾病或损伤时，不同的细胞类型均会发生不同程度的细胞焦亡现象[17]。

神经元是中枢神经系统主要的结构功能单位，且可发生细胞焦亡现象。Kesavardhana和Kanneganti[18]通过对人类胎儿神经元的免疫组织化学检测出NLRP1、ASC、黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)、NLRC4和caspase-1等蛋白，表明神经元细胞常规存在大量炎症小体的组成分子。有研究表明，高水平的IL-1对神经元有毒性作用[19]，但神经元仍可通过激活NLRP1、AIM2或NLRC4炎症小体引发细胞焦亡，释放IL-1炎症因子[20]，其中NLRP1炎症小体的表达量远大于AIM2和NLRC4炎症小体[21]。中枢神经系统中的脑巨噬细胞样细胞包括小胶质细胞和围绕在血管、脉络膜丛、脑膜周围的巨噬细胞，脑巨噬细胞样细胞在稳态下常规表达炎症小体的组成成分，在神经炎症状态下其表达量明显升高[22]。在人类胎儿小胶质细胞中已检测出NLRP1、AIM2、caspase-1和ASC的常规转录表达，而NLRP3的表达一般需要外界刺激的诱导[23]。在体外实验中，小胶质细胞的胞质组成性表达GSDMD蛋白，当细胞受到外界刺激(如ATP或尼日利亚霉素)时，NLRP3炎症小体被高度诱导表达，GSDMD蛋白水平显著上调，促进了细胞焦亡的发生[24]。少突胶质细胞在中枢神经系统中包绕轴突形成髓鞘，使生物电信号跳跃式高效传递。在细胞焦亡现象被发现之前，Hisahara等[25]在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的少突胶质细胞中观察到caspase-11的活化表达。利用GSDMD蛋白作为检测细胞焦亡标志物的研究证实，少突胶质细胞在肿瘤坏死因子-α暴露和EAE期间均发生caspase-1依赖的细胞焦亡[25]。星形胶质细胞在大脑内分布广泛，可分泌神经递质，参加对外源性化合物的生物转化。现发现星形胶质细胞中也存在多种炎症小体，如NLRP2炎症小体在成人的星形胶质细胞中以连接蛋白的方式被ATP激活[23]。此外，在人类胎儿的星形胶质细胞中还检测到NLRP1、AIM2、NLRC4、caspase-1和ASC的转录合成[26]。虽然NLRP3炎症小体在星形胶质细胞中处于低表达状态，但刺激因素[如重组β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)]可加速诱导小鼠星形胶质细胞中NLPR3的转录合成，促使细胞焦亡发生[27]。

由此可见，中枢神经系统中各种细胞类型的细胞焦亡均已被证实，但目前大多数研究仅聚焦于疾病相关的刺激因素和单种细胞类型的细胞焦亡，尚缺乏不同刺激因素或不同细胞类型的炎症小体激活和细胞焦亡的差别研究。

3 细胞焦亡与中枢神经系统疾病

细胞焦亡与中枢神经系统疾病的发生发展密切相关[28-29]。因此，在不同的刺激条件下激活炎症小体，促进炎症因子释放，诱发细胞焦亡，可能是中枢神经系统疾病的发病机制之一。

3.1细胞焦亡与中枢神经系统感染性疾病 脓毒症期间，全身的炎症反应会影响中枢神经系统的功能，血脑屏障的渗透性增高、细胞内炎症因子的大量释放以及神经认知的破坏均可导致脓毒症脑病的发生[30]。研究表明，细胞焦亡参与了脓毒症脑病的疾病进展，通过抑制caspase-1或NLRP3炎症小体的生成可以提高脓毒症脑病模型小鼠的存活率，缓解神经认知缺陷[31-32]。而在中枢神经系统直接发生病毒或细菌感染的情况下，细胞焦亡也起到重要作用。例如，许多病毒包括人类免疫缺陷病毒、西尼罗河病毒和寨卡病毒可以激活神经元和星形胶质细胞中的NLRP3炎症小体，诱发细胞焦亡，促进疾病发展[33-35]；在金黄色葡萄糖球菌脑脓肿动物模型中也检测出NLRP3和AIM2炎症小体[36]。可见，细胞焦亡与中枢神经系统感染性疾病密切相关，由于细胞焦亡、病毒裂解及炎症因子释放均会影响感染细胞和正常细胞的生存，炎症小体的激活过程与中枢神经系统感染下的细胞死亡之间的复杂关系仍有待阐明。

3.2细胞焦亡与中枢神经系统损伤 中枢神经系统损伤包括创伤性脑损伤和脊髓损伤。中枢神经系统的损伤包括两个阶段，第一阶段为初始损伤，细胞发生坏死，广泛释放DAMPs；第二阶段为继发性神经炎症级联反应，包括神经胶质细胞激活、血脑屏障通透性改变、活性氧激活以及细胞因子、趋化因子释放[37]。在第二阶段中，因接触了大量DAMPs细胞焦亡过程被启动，释放细胞炎症因子，促进炎症级联反应的扩散。对脑外伤后脑脊液的分子检测发现，caspase-1水平升高，并检出ASC、NLRP1炎症小体[4]。Adamczak等[38]研究发现，神经元损伤后细胞内AIM2炎症小体被激活，促进IL-1β释放和细胞焦亡；该实验将正常神经元置于脑外伤后的脑脊液中培养，发现正常神经元内的caspase-1激活和AIM2炎症小体表达增加，表明损伤裂解的细胞会释放游离DNA到脑脊液中，这可能是激活AIM2炎症小体的启动信号，但具体机制仍待进一步探讨。目前研究已证实，多种炎症小体包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2均与创伤性脑损伤有关，体现了中枢神经系统损伤机制的多样性[39]。

3.3细胞焦亡与脑卒中 缺血性脑卒中的发病机制包含复杂的炎症反应，其过程涉及梗死区域内神经细胞免疫反应的激活和循环中大量炎症细胞的募集，两者共同促进脑卒中的病理发展。研究表明，在体内和体外条件下的缺血性脑卒中动物模型中，AIM2炎症小体均发生活化，诱导细胞焦亡[40]。在模型中，删除或抑制炎症小体成分(包括炎症小体相关的细胞因子、NLRP1、AIM2、NLRC4、ASC和caspase-1/11)均对脑损伤有保护作用[22,41]；甚至在脑梗死早期(30 min内)，神经元细胞中即可检出活化的caspase-1[42]，这可能为极早期干预脑梗死进程提供新思路。在血栓性脑梗死动物模型中，神经细胞对各种炎症小体的组成成分呈免疫阳性，包括NLRP1、ASC和caspase-1[43]。Xu等[44]对局灶性脑缺血模型进行深入研究发现，在小胶质细胞中髓样细胞触发受体-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1，TREM-1)和脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，SKY)的下游，IL-1和IL-18表达上调并伴随GSDMD蛋白表达、裂解增加，通过透射电子显微镜证实，小胶质细胞膜上GSDMD蛋白孔密度更高，提示TREM-1和SYK可能是脑缺血病程中细胞焦亡的上游启动信号，因此通过注入SYK抑制剂可以减轻细胞焦亡，缓解脑梗死进展[45]。综上，阻断细胞焦亡可以影响缺血性脑卒中的进展，可作为治疗脑卒中的一种潜在靶点。

3.4细胞焦亡与神经退行性疾病 炎症小体参与中枢神经系统退行性疾病的发生发展，如AD、帕金森病和运动神经元病等。AD是一种与Aβ形成、神经原纤维缠结及神经元炎症死亡等相关的神经退行性疾病，其中Aβ纤维被认为是毒害神经的主要物质[46]。AD患者大脑中的小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元以及脑脊液中均检测到IL-1、IL-18和IL-1β，这些促炎因子被认为能够促进AD的进展[47]，且AD患者神经元中也可检测到NLRP1炎症小体[19]，可见炎症因子的释放和细胞焦亡在AD发病机制中发挥重要作用。研究发现，Aβ纤维与细胞焦亡关系密切，在体外实验中，Aβ纤维可以诱导星形胶质细胞和小胶质细胞释放ASC和NLRP3依赖性的IL-1β炎症因子，而在AD患者脑组织和AD动物模型中均检测到Aβ纤维与ASC的结合，且该模型中，ASC的遗传缺陷和抗体阻断可以防止Aβ纤维聚集，表明细胞焦亡释放的ASC有助于Aβ纤维的聚集沉积。因此未来可尝试通过抑制ASC来延缓AD的发生[48-49]。Tan等[50]在AD动物实验中发现，Aβ纤维可以诱导NLRP1炎症小体形成，促使神经元发生caspase-1依赖性的细胞焦亡；通过NLRP1抑制剂可以减少神经元细胞死亡。鉴于以上研究，仅靶向针对Aβ纤维还不足以预防AD的发生，探索细胞焦亡与AD发病机制之间的关系可能是重要的突破途径。此外，细胞焦亡与帕金森病也密切相关，通过抑制炎症小体的激活能有效减少多巴胺能神经元的死亡[51]。

3.5细胞焦亡与多发性硬化症 多发性硬化症的病理特征为中枢神经系统炎性脱髓鞘性病变，其病因尚不明确。活动性多发性硬化症患者血清、脑脊液和白细胞中IL-18、IL-1β、NLRP3和caspase-1表达均升高，其中脑脊液中的IL-1β表达水平与中枢神经系统皮质脱髓鞘病变数量和严重程度呈正相关[52-53]。EAE动物模型是多发性硬化症理想的动物模型，通过特异性致敏的CD4+T细胞导致中枢神经系统单核细胞浸润，从而诱发炎性髓鞘脱失。在体内的脱髓鞘病变和正常白质小胶质细胞中均可检测出炎症小体的组成成分，包括caspase-1和IL-1β[54]，而EAE动物模型小胶质细胞中GSDMD蛋白表达水平较高，提示细胞焦亡参与了疾病的发生[23]。Jha等[55]发现在EAE动物模型中，敲除炎症小体组成成分(如IL-1β、ASC、NLRP3及caspase-11)会明显缓解神经炎症程度。因此，有研究尝试通过药物抑制细胞焦亡，减少EAE的疾病进展，如通过NLRP3酶抑制剂(MCC950)减少IL-1β的产生，或通过caspase-1抑制剂(VX-765)阻断细胞焦亡，从而减轻神经炎症，缓解神经变性[56-57]。目前认为，多发性硬化症的发病机制包括细胞凋亡、坏死及焦亡等细胞死亡机制，因此进一步探究中枢神经系统微环境中多种细胞死亡之间的相互作用可能有助于开发更好的神经保护策略。

4 小 结

细胞焦亡作为一种新型炎症细胞死亡类型，在多种中枢神经系统疾病的发病机制中发挥重要作用。调控细胞焦亡的激活途径可影响中枢神经系统炎症、创伤、缺血性卒中、神经退行性病变及多发性硬化症等的发生发展。GSDMD蛋白是细胞焦亡的主要执行者，通过特定GSDMD蛋白抑制剂缓解细胞焦亡在发病中的作用，目前在动物模型上已取得良好的成效，并可能成为神经炎症和神经退行性病变的一种可行神经保护策略。未来仍有许多重要问题有待解决，如需要进一步界定神经炎症和神经退行性疾病中炎症因子的产生和细胞焦亡之间的关系；神经元细胞具有终末分化、更新能力低下、组织结构复杂精细等特性，在细胞焦亡刺激下可能呈现独特的反应。此外，在不同疾病背景和不同细胞类型条件下，细胞焦亡的区别有待利用单细胞RNA测序、质谱分析及高分辨率显微镜来进一步阐明。因此，深入探究细胞焦亡与中枢神经系统疾病的相关性，不仅可以进一步阐明疾病的发病机制，还可为疾病的治疗提供新方向。