达格列净预处理对心肌缺血再灌注损伤模型兔血清hs-cTnT、心肌结构及细胞凋亡的影响

李伟，马建群，朱玉红

(1.山东第一医科大学第三附属医院心血管内科，济南 250031； 2.滨州医学院附属医院病理科，山东 滨州 256603)

随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，心血管疾病已成为影响人类健康的首要问题。《中国心血管健康与疾病报告2020》显示，我国大约有3.3亿心血管疾病患者，其中冠心病患者约有1 139万[1]。心肌缺血是动脉粥样硬化和心肌梗死引起的常见临床症状[2]。再灌注治疗有利于修复缺血后损伤的心肌结构，改善心功能。然而，再灌注也可能导致心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)，从而加重心功能不全。缺血预处理、后处理和服用抗血小板或抗血栓药物等已被用于缓解MIRI[3-4]。由于MIRI的发生机制复杂多样，药物防治的临床研究结果并不一致。目前我国批准使用的钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂包括达格列净、恩格列净、卡格列净，近年来已被广泛研究[5-6]。达格列净传统上是一种降糖药物，但多项研究表明其对缺血性心脏病和心力衰竭患者的心功能有益[7-9]。因此，达格列净被认为是MIRI的一种潜在治疗方法。本研究主要探讨达格列净预处理对MIRI的影响，为进一步拓展达格列净在预防和治疗心血管疾病中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 选取普通级雄性成年新西兰大白兔18只，体重(2.0±0.3) kg，购自济南西岭角养殖繁育中心[许可证号：SCXK(鲁)2020-0004]。所有兔按标准适应性饲养1周后进行实验，实验前禁食12 h。

1.1.2仪器与试剂 医用低温保存箱(BDF-86V348，济南鑫贝西生物技术有限公司)，电子分析天平(JA2003，上海上天精密仪器有限公司)，医用离心机(BY-320A，北京白洋医疗器械有限公司)，全自动化学发光免疫分析仪(UD90DT，北京联众泰克科技有限公司)，全自动包埋机(Tissue-Tek TEC)、全自动脱水机(Tissue-Tek VIP)、全自动染色封片一体机(Tissue-Tek Prisma)均购自日本Sakura公司，全自动石蜡切片机(RM2245，德国Leica公司)，全自动数字病理切片扫描仪(宁波江丰生物信息技术有限公司)；达格列净(美国Astra Zeneca Pharmaceuticals LP公司，批号：2104240)；高敏心肌肌钙蛋白T(high-sensitive cardiac troponin T，hs-cTnT)(北京联众泰克科技有限公司，批号：20210722)；末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(teminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒(批号：MPC2107025)、蛋白酶K(批号：MPC2107048)均购自武汉赛维尔公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及心肌缺血再灌注模型制备 18只新西兰大白兔按照随机数字表法分为假手术组、模型组、达格列净组，每组6只。模型组参照文献[10]的方法并进行改良：经兔耳缘静脉缓慢注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg，等待兔的四肢变得松软，睫毛反射消失后将其固定于实验动物台上。连接心电图机，胸前区备皮并消毒。沿胸骨左缘寻找第3～4肋间，切开皮肤、皮下组织及部分肌肉，再用小止血钳进行钝性分离，注意无气胸开胸，擦除血迹，如有组织内小动脉出血立即给予结扎。用扩胸器充分撑开以增加手术视野，用弯头镊子夹住胸膜，用眼科剪剪开纵隔胸膜，然后用弯头镊子夹持壁层心包，缓慢提起，用眼科剪纵向剪开壁层心包，充分暴露心脏。在手术野下用两根棉签轻轻夹持着心脏并向右侧轻度旋转以充分暴露冠状动脉的左前降支。用3-0缝合线在兔心脏左前降支中、上1/3交界处穿绕并在其表面平行放置一束线。观察3～5 min后，记录心电图。将缝线穿过心肌，在束线上打两个活结，并拉紧两端，结扎左前降支。其特点是心电图V1导联出现明显的ST段抬高，结扎线以下的心肌明显发绀。整个手术过程中进行心电监测。结扎40 min后，用弯头镊提起结扎处的缝合线和束线，用眼科剪剪断，恢复冠状动脉左前降支血流，使心肌缺血区进行再灌注120 min。假手术组在左前降支的下方只穿线，不结扎；达格列净组在结扎前20 min经兔耳缘静脉给予达格列净0.5 mg/kg，其余步骤均不变。

造模评价：冠状动脉左前降支结扎成功的标志是左心室前壁心肌颜色变暗、向外膨胀同时伴V1导联心电图显示ST段抬高。成功的再灌注的特点是去除结扎后，心电图上的ST段抬高减少≥50%。模型组与达格列净组均造模成功。

1.2.2标本采集 分别于结扎前、结扎后40 min、再灌注120 min时从心脏处收集血液1.5 ml，在4 ℃冰箱静置30 min，以1 610×g离心15 min后收集上清液，置于-80 ℃冰箱冷冻保存，采用全自动化学发光免疫分析仪统一检测血清hs-cTnT水平。

1.2.3心肌组织病理学改变 实验结束后，从结扎线下1 mm的同一区域提取心肌组织，在10%甲醛溶液中固定，待苏木精-伊红染色。石蜡包埋，用石蜡切片机切出厚度为5 μm的切片。切片经过脱蜡、水洗、染色、脱水、透明、封片一系列过程后，光学显微镜下观察，并进行拍照。

1.2.4TUNEL法检测细胞凋亡 在经过脱蜡和脱水后，用TUNEL法检测兔心肌组织切片的凋亡情况，该操作严格按照试剂盒说明书进行。凋亡指数=视野范围内的凋亡细胞数/视野范围内的所有心肌细胞数。每个切片在高倍镜下对5个视野区域进行计数，并计算平均值。其中凋亡心肌细胞的细胞核呈深褐色，而正常心肌细胞的细胞核呈蓝色。

2 结 果

2.1兔心肌缺血再灌注过程中心电图变化 将心电图机的走纸速度设置为50 mm/s，定标电压为10 mm/mV，持续心电监测并记录单一胸导联(将V1导联放置于剑突与胸骨柄交界处)心电图。与结扎前相比，兔冠状动脉左前降支结扎后V1导联的ST段迅速呈弓背向上抬高，见图1a、1b；随着再灌注时间的延长，ST段逐渐下降，见图1c。

2.2各组兔血清hs-cTnT水平比较 不同时点间hs-cTnT水平的主效应差异有统计学意义(P<0.01)，不考虑测量时间，组间hs-cTnT水平的主效应差异有统计学意义(P<0.01)，组间和时点间存在交互作用(P<0.01)；结扎前3组hs-cTnT比较差异无统计学意义(P>0.05)。结扎后40 min和再灌注120 min，模型组与达格列净组血清hs-cTnT均显著高于假手术组(均P<0.01)；结扎后40 min、再灌注120 min，达格列净组血清hs-cTnT明显低于模型组(P<0.01)；模型组与达格列净组血清hs-cTnT均随着缺血及再灌注时间延长而增加(P<0.01)。见表1。

图1 兔心肌缺血再灌注过程中心电图变化 1a为结扎前，1b为结扎后，1c为再灌注后

表1 三组兔血清hs-cTnT水平比较

2.3各组兔心肌缺血区组织病理变化 假手术组心肌组织苏木精-伊红染色表现为心肌细胞染色均匀，颜色深浅一致，心肌纤维排列整齐，细胞间隙正常，未出现心肌细胞坏死，见图2a。模型组的心肌组织病理改变明显，心肌细胞染色深浅不一，细胞水肿明显，排列紊乱，出现严重的心肌纤维溶解断裂，细胞核边缘模糊显示不清，见图2b。达格列净组心肌细胞红染较假手术组略深，心肌纤维排列介于模型组和假手术组之间，未见严重的心肌纤维断裂现象，细胞核边缘较为清晰，见图2c。

图2 各组兔心肌缺血区组织病理切片情况 (苏木精-伊红染色，×200) 2a为假手术组，2b为模型组，2c为达格列净组

2.4各组兔心肌组织凋亡情况比较 假手术组、模型组、达格列净组凋亡指数分别为(10.0±0.9)%、(42.4±1.5)%、(28.6±1.2)%，各组比较差异有统计学意义(F=1 014.544，P<0.001),与假手术组相比，模型组与达格列净组凋亡指数均增加(P<0.01)，而与模型组相比，达格列净组凋亡指数降低(P<0.01)。在模型组中检测到大量的凋亡细胞，而达格列净组的心肌中凋亡细胞数量明显减少，见图3。

3 讨 论

再灌注治疗对于ST段抬高型急性心肌梗死患者是一种非常重要的治疗手段，但同时也是一把“双刃剑”。当缺血心肌组织再次获得血液灌注时，可为缺血心肌细胞提供必要的氧气和营养，恢复其结构和功能。然而，临床上一些患者在恢复血液灌注后器官或组织的缺血性损伤并没有减少或恢复，反而进一步加重心肌损伤[11-12]。本实验结果显示，与假手术组相比，模型组和达格列净组心肌组织苏木精-伊红染色均有明显的病理改变，表明心肌缺血再灌注过程加剧了心肌损伤。

为了缓解缺血再灌注损伤，Murry等[13]首先提出了缺血预处理的概念，其可有效减少缺血再灌注损伤。随后Zhao等[14]提出缺血后处理的方法，多项研究结果表明，缺血预处理和缺血后处理均可减小梗死面积，改善心功能[15-17]。然而，缺血预处理和缺血后处理应在创伤的前提下进行，因此，在临床上并没有推行。药理预处理的优点是创伤小、操作简单，是一种可行的临床治疗方法。已有研究只能说明达格列净对MIRI合并糖尿病大鼠心肌具有一定的保护作用[18-19]，而对不合并糖尿病的MIRI模型的研究较为少见。因此，本实验建立了一个与人心肌缺血再灌注相似的、比较成熟的、可重复的、短实验周期的兔心肌缺血再灌注模型，观察达格列净预处理对MIRI心肌的影响。

达格列净是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，被广泛用于心血管和肾脏疾病的细胞保护[20-22]。血清hs-cTnT是心肌损伤时具有高灵敏度和特异度的血清学指标，即使是细微的心肌损伤变化也能检测出其表达[23]。本研究结果中，结扎后40 min、再灌注120 min时，达格列净组血清hs-cTnT均显著低于模型组，在一定程度上证实了达格列净对MIRI的治疗作用。目前有关达格列净对心肌细胞抗凋亡作用的相关实验较少。本实验结果显示，与模型组相比，达格列净组心肌中的凋亡细胞数量明显减少，与以往的研究一致[24]。因此，认为达格列净对心肌细胞有抗凋亡作用。

综上所述，达格列净可以减轻MIRI，对受损的心肌有保护作用。但本实验仅局限于对心肌结构、心肌损伤特异性标志物及细胞凋亡影响的探讨，关于达格列净对MIRI心肌的保护作用及具体机制通路有待进一步研究。

注：TUNEL为末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记