基于GC-MS和网络药理学研究七味广枣散挥发油防治心血管疾病的成分及机制

李书迪， 齐和日玛， 于景华， 郭慧卿， 王鑫晶， 成日青*

(1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学第一附属医院，内蒙古 呼和浩特 010059)

随着人们生活习惯及饮食结构的改变，心血管疾病在我国的发病率及死亡率逐年上升。据《中国心血管病报告2018》统计，我国心血管疾病死亡率居城乡居民死亡原因首位，占死亡构成的40%以上，已成为当今社会人群健康所面临的重要公共卫生问题[1]。

七味广枣散为临床常用的蒙古族验方，由广枣、丁香、肉豆蔻、沉香、木香、枫香脂、牦牛心7味药材组成，具有养心益气，安神之功效，用于防治胸闷疼痛、心悸气短、心神不安、失眠健忘等症。方中丁香、沉香、肉豆蔻、木香、枫香脂均富含挥发油成分，易透过血脑屏障，具有药理活性丰富、起效靶点多、不良反应较少等特点[2]，该类成分除了具有抗炎、抑菌、抗病毒活性外，还具有保护血管内皮、抗氧化、改善心肌功能、调节心血管活性等多种对心血管有益的作用[3-7]。蒙医药在防治心血管疾病方面具有一定特色优势，有多种临床常用、效果显著的传统方剂，如三味檀香散、肉豆蔻五味丸、阿敏·额尔敦、八味沉香散等，其组成均含挥发性药味，如肉豆蔻、沉香、木香、丁香等，表明在抗心血管疾病类蒙药处方中挥发油可能是一类重要的有效成分，但目前相关研究较少。因此，本研究通过GC-MS对七味广枣散挥发油进行成分分析，并借助网络药理学筛选出防治心血管疾病的主要活性成分、关键靶点及潜在信号通路，从系统生物学角度探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 仪器 Trace DSQⅡ GC-MS仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；ZTB-A磁力加热搅拌电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；800Y型多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；10 mL挥发油提取器(安徽省天长市东亚玻璃仪器厂)。

1.2 药材与试剂 广枣(产地广东，批号C17082902)、丁香(产地广西，批号193090101)、木香(产地云南，批号1811001)、沉香(产地海南，批号181411001)、肉豆蔻(产地广西，批号190920201)、牦牛心(产地西藏，批号170701)、枫香脂(产地福建，批号1811010589)均购自内蒙古天康蒙中医药有限责任公司，经内蒙古医科大学渠弼教授鉴定为正品。乙酸乙酯为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 挥发油提取 参照2015年版《中国药典》四部通则中“2204挥发油测定法”项下“甲法”操作，称取七味广枣散120 g，加5倍量水回流提取6 h，得黄色澄明液体，即为挥发油。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC条件 TR-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升温(初始温度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升温至280 ℃，保持3 min)；进样口温度250 ℃；检测器FID，温度240 ℃；载气氮气，纯度99.99%，体积流量1.0 mL/min；分流比50∶1；氢气体积流量20 mL/min；空气体积流量400 mL/min；进样量2 μL。

2.2.2 MS条件 EI电离；离子源温度250 ℃；接口温度250 ℃；电子轰击能量70 eV；溶剂延迟3 min；扫描范围m/z50～650。

2.2.3 挥发油成分分析 取“2.1”项下挥发油适量，乙酸乙酯溶解后在“2.2”项条件下进样测定，质谱数据经NIST 2.0质谱数据库检索匹配后再与文献[8-11]报道比对，确定各化学成分。

2.3 网络药理学研究

2.3.1 成分数据收集 以“2.2.3”项下鉴定出的成分为研究对象，在Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中以成分的CAS号为检索词，得到其分子结构，并保存为Canonical SMILES格式。

2.3.2 成分靶点获取 将“2.3.1”项下SMILES格式文件导入SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)、SuperPred 数据库(http://prediction.charite.de/)中，选定研究物种为“Homosapiens”，得到成分的对应靶点，保存数据，整合、去重后得到化合物的潜在作用靶点。

2.3.3 疾病靶点获取 使用DisGeNET 数据库(https://www.disgenet.org/)，以心血管相关疾病为关键词进行检索，获得作用靶点，将其导入Excel表格中，整合、去重后得到疾病的潜在作用靶点。

2.3.4 潜在作用靶点获取 将化合物、疾病的靶点录入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线作图工具平台上，绘制韦恩图，得到两者交集(即共同靶标)，作为潜在作用靶点。

2.3.5 网络模型构建及分析 将“2.3.4”项下潜在作用靶点及其对应成分分别导入Cytoscape 3.6.0软件，构建“化学成分-作用靶点”网络，使用 Network Analyzer功能对网络进行分析，根据节点Degree、Betweenness、Closeness筛选出七味广枣散挥发油防治心血管疾病的主要活性成分。

2.3.6 PPI网络构建及分析 将“2.3.4”项下筛选得到的交集靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)中，构建蛋白相互作用网络模型，选择物种为“Homosapiens”，设定最低相互作用阀值为“Highest confidence(0.9)”，其余参数保持默认设置，获得蛋白相互作用信息，保留文件中的节点信息(node1、node2)并将其导入 Cytoscape 3.6.0软件，构建PPI网络并进行拓扑指标分析，筛选出关键靶点。

2.3.7 富集分析 将筛选得到的关键靶点输入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中，进行GO富集分析(包括生物过程、细胞组分、分子功能)和KEGG信号通路分析。

2.3.8 分子对接 通过PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载靶蛋白的3D结构并保存为PDB格式，通过Pubchem数据库下载成分的3D结构并保存为SDF格式，将准备好的靶蛋白和化合物分子结构导入Discovery Studio软件，进行分子结构常规预处理，再选择Libdock模块进行分子对接，分析其结合活性。

3 结果

3.1 挥发油成分鉴定 挥发油总离子流图见图1，通过质谱数据库检索及文献比对，共鉴定出35种成分，其中丁香酚含量最高，占总量的42.83%，其次是肉豆蔻醚，占总量的7.06%，见表1。

图1 挥发油GC-MS总离子流图

3.2 潜在靶点收集 将 Swiss、SuperPred数据库中得到的预测靶点去重后，共得到成分靶点341个，通过DisGeNET数据库得到疾病靶点2 943个，在Venny 2.1.0在线作图工具平台上输入成分、疾病的靶点，绘制韦恩图(图2)，两者取交集后得共同靶点188个。

图2 成分、疾病靶点的韦恩图

3.3 化学成分-作用靶点网络构建及分析 将化学成分及188个潜在作用靶点导入Cytoscape软件，绘制网络图(图3)，并通过Network Analyzer 对网络图进行分析。结果显示，丁香酚、黄樟醚、桉叶素、α-细辛醚、异丁香酚、α-松油醇、甲基丁香酚、杜松醇、肉豆蔻醚均能与25个以上靶点相连接，可能在防治心血管疾病过程中发挥重要作用，同时3-侧柏烯、桉叶素、3-蒈烯、檀香醇、黄樟醚、杜松醇、丁香酚、甲基丁香酚、α-松油醇、苯甲醛又可共同作用于靶点ACHE，体现了挥发油多成分、多靶点的综合调节特点。

表1 挥发油成分分析结果

图3 化学成分-作用靶点相互作用网络图

3.4 PPI网络构建 在STRING数据库中录入188个潜在作用靶点，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape软件对上述数据进行可视化分析，构建PPI网络，并对网络进行筛选，计算度值(Degree)、中介中心性(Betweeness)、接近中心性(Closeness)的中位数，以高于3者为标准，筛选出47个关键靶点，见表2，其中度值最高的为APP，能与35个蛋白发生相互作用，其次是PIK3CA、MAPK1、STAT3、SRC，分别能与29、28、27、27个蛋白发生相互作用。PPI网络图见图4，节点越大，颜色越深，靶点度值越高；颜色越浅，节点越小，代表度值越低。

图4 PPI网络图

表2 关键靶点信息

3.5 靶点通路分析 将47个关键靶点通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，得到139个条目(P<0.001)，包括91个生物学过程(排名前20条目绘制柱状图，图5A)、14个细胞组分(图5B)、34个分子功能(排名前20条目绘制柱状图，图5C)，提示生物过程(BP)显著富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、血小板活化、NO生物合成、凋亡过程的调控、细胞增殖的调控等；细胞组分(CC)主要涉及核染色质、核浆等；分子功能(MF)主要集中在转录因子结合、酶结合、激酶活性、蛋白质磷酸酶结合等。

图5 GO功能富集分析

利用DAVID数据库对交集靶点进行KEGG通路分析，以P<0.001为条件，共筛选出67条信号通路，应用Omicshare (http://www.omicshare.com/) 对前20条通路富集分析结果作气泡图，结果见图6。由此可知，靶点数排名靠前的为胰腺癌通路(pancreatic cancer)、甲状腺激素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、催乳素信号通路(prolactin signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、前列腺癌(prostate cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)等，表明挥发油可通过作用于不同的通路来防治心血管疾病。

图6 KEGG通路富集分析

3.6 分子对接验证 选择PPI网络中度值排名前五的关键靶点与其对应的活性成分进行分子对接，结果见表3，得分越高，分子与受体结合越好。由此可知，APP与α-细辛醚、异丁香酚结合的可能性相对较高，PIK3CA与甲基丁香酚，SRC与丁香酚、异丁香酚的结合效果也相对较好。APP与α-细辛醚、SRC与丁香酚的分子对接模式见图7。

表3 分子对接结果

图7 APP与α-细辛醚、SRC与丁香酚分子对接模式图(A、B)和细节2D展示图(a、b)

4 讨论

本研究通过对“化学成分-作用靶点”网络进行拓扑学分析，筛选出9种关键成分。其中，丁香酚在挥发油测定结果中峰面积占比最大，同时在拓扑学分析中Degree值最高。现代药理学研究表明，丁香酚除具有抑菌、抗炎、抗氧化、麻醉等药理作用外，在心血管方面还表现出降压、抗心律失常和保护心肌细胞等作用[12-13]。研究发现，丁香酚能提高Na2S2O4造成的缺氧/复氧损伤心肌细胞的存活率[14]，对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤也具有保护作用[15]。

通过Cytoscape对潜在作用靶点得到的蛋白互作信息进行拓扑学分析，筛选出关键靶点47个，靶点间通过769条相互作用协同影响疾病的防治。关键靶点和活性成分的对接结果显示，除MAPK1与桉叶素、STAT3与异丁香酚结合效果不佳外，其余成分与靶点间均有较好的结合能力。

GO分析富集结果显示，47个关键靶点主要分布在139个GO功能过程，其中包括91个生物过程，如转录的调节、血小板活化、NO生物合成、凋亡过程的调控、细胞增殖、细胞迁移等。这些生物过程贯穿于药物治疗疾病的整个作用机制中，表明七味广枣散挥发油可通过调控多个生物学过程来发挥防治心血管疾病的作用。

KEGG富集结果表明，关键靶点主要富集于胰腺癌、甲状腺激素、HIF-1等67条信号通路。其中，HIF-1信号通路、VEGF信号通路、cAMP信号通路在心血管疾病的防治过程中起重要作用。VEGF是目前所发现的唯一特异性地促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，具有促进血管新生和增加血管通透性等多种功能，通过降低或抑制VEGF的表达，可以减少血管新生，防治动脉粥样硬化的发生发展[16]。心肌缺血及缺氧时，缺氧区域三磷酸腺苷(ATP)生成障碍，而在缺氧条件下缺氧诱导因子-1(HIF-1)稳定表达，可参与调控醛缩酶和丙酮酸激酶等改善能量代谢，调控缺氧适应，也可诱导VEGF转录和表达从而促进血管新生，并影响炎症发生等多种途径[17-18]。cAMP是一种环状核苷酸，可以使蛋白激酶A(PKA)激活，还使cAMP底物蛋白磷酸化，加速对钙的摄取和转运[19]，从而调节钙稳态，心肌收缩，细胞命运和基因转录等。

综上所述，本研究借助GC-MS技术和网络药理学方法，初步探讨了七味广枣散挥发油防治心血管疾病的活性成分及可能作用机制，为后续进一步的实验研究提供了思路及理论依据。