香叶木素自微乳的制备

赵艺宁， 韩叶枫， 梁建坤， 刘晓娟

(锦州医科大学药学院，辽宁 锦州 121000)

香叶木素存在于菊花、留兰香、蜘蛛香等天然药物和柠檬、柑橘、花生等果实中，是天然黄酮类化合物[1]，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎，抑制细胞凋亡等作用，被广泛用作静脉血管疾病(如下肢静脉溃疡、痔疮)的血管保护剂[2]。但该成分在水中的溶解度较低，并且人体内存在肝-肠循环以及肠-肠循环，高首过效应使其口服吸收差，体内生物利用度低，从而限制了相关产品的研发与临床应用。

自微乳是难溶性药物增溶研究的热点之一，它由油相、乳化剂、助乳化剂按适当比例组成，在适宜水相中温和搅拌的情况下，可自乳化成粒径小于100 nm的O/W 型热力学稳定的油水混合系统[3]，能增加药物膜渗透性，促进淋巴转运，避免首过效应，从而有效改善药物生物利用度，掩盖不良气味，减少对胃肠道的刺激性。本实验将香叶木素制成自微乳，以期提高该成分口服吸收利用度。

1 材料

香叶木素(批号EG110090，萨恩化学技术上海有限公司)。油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；油酸聚乙二醇甘油酯、中链甘油酸酯、丙二醇月桂酸酯、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、乙二醇单乙基醚(德国Sasol公司)；单亚油酸甘油酯(法国Gattefosse公司)；橄榄油、蓖麻油聚氧乙烯醚(上海麦克林生化科技有限公司)；吐温80(天津天力化学试剂有限公司)；聚乙二醇400(苏州华晨化工有限公司)。异丙醇(天津水晟精细化工有限公司)；甲醇(天津大茂化学试剂厂)；1,2-丙二醇(天津永晟精细化工有限公司)。

TD型电子天平(上海托利多仪器有限公司)；KQ-300V型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；WH-2微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂)；TGL-16高速离心机(江苏金坛市中大仪器厂)；UV2550紫外可见分光光度计(日立岛津公司)；95-1双向磁力加热搅拌器(德国IKA公司)；RC-8溶出度测试仪(天津市国铭医药设备有限公司)；康氏振荡器(金坛市医疗仪器厂)；Nano-ZS90激光粒度仪(日立高新技术集团)；JEM-1400Flash透射电镜(日本电子株式公社)。

2 方法与结果

2.1 香叶木素含量测定

2.1.1 检测波长确定 精密称取香叶木素原料药25 mg，甲醇稀释至5 mg/mL，在200～400 nm波长范围内进行扫描[4]，发现最大吸收波长为343 nm。将载体材料在上述最大吸收波长下进行紫外检测，发现它无吸收干扰，对含量测定无影响，故选择其作为检测波长。

2.1.2 线性关系考察 精密称取香叶木素对照品25 mg至50 mL量瓶中，甲醇超声溶解，定容，摇匀，制成贮备液，精密量取25、50、75、100、125、150 μL至10 mL量瓶中，制成对照品溶液，在343 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=0.098 5X+0.073(R2=0.999 6)，在1.25～7.50 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 分别吸取低(2.5 μg/mL)、中(5 μg/mL)、高(7.5 μg/mL)质量浓度对照品溶液适量，同一天内在343 nm波长处测定吸光度5次，计算日内精密度；每天于同一时间点测定1次，连续5 d，计算日间精密度，测得前者RSD分别为0.58%、0.20%、0.19%，后者RSD分别为0.35%、0.23%、0.13%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验 精密称取香叶木素对照品适量，按“2.1.2”项下方法制备3.75 μg/mL溶液，在343 nm波长处测定吸光度6次，测得其RSD为0.51%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 加样回收率试验 分别在不同质量浓度对照品溶液中加入一定量空白自微乳，混匀后加入甲醇破乳，测得加样回收率分别为98.69%、99.60%、99.16%，RSD分别为0.59%、0.72%、0.79%。

2.2 溶解度测定 取油相、乳化剂、助乳化剂各4 mL至EP管中，加入过量香叶木素，混匀后超声处理2 h，于37 ℃恒温水浴振荡器中放置48 h，10 000 r/min离心10 min，取上清液，甲醇稀释至适宜质量浓度，在343 nm波长处测定吸光度，计算溶解度[5]，结果见表1。由此可知，香叶木素在油相中的溶解度依次为为橄榄油>油酸乙酯>肉豆蔻酸异丙酯>油酸聚乙二醇甘油酯>中链甘油酸酯，在乳化剂中的溶解度依次为吐温80>辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯>蓖麻油聚氧乙烯醚>单亚油酸甘油酯>丙二醇月桂酸酯，在助表面活性剂中的溶解度依次为聚乙二醇400>1,2-丙二醇>乙二醇单乙基醚>异丙醇。最终，选择橄榄油、油酸乙酯作为油相，吐温80作为乳化剂，聚乙二醇400作为助乳化剂。

表1 香叶木素在各辅料中的溶解度

2.3 油相筛选 将吐温80与聚乙二醇400按质量比(Km)1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1混匀后，再与橄榄油按Km1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1振荡混匀，量取1 mL至烧杯中，缓慢加水滴定，稀释至50倍，观察溶液澄清度，同时记录乳化时间[6]。预实验发现，将橄榄油作为油相时加水乳化后，溶液表面有少量油状漂浮物，比较浑浊，证明橄榄油未乳化完全，故选择油酸乙酯作为油相。

2.4 伪三元相图绘制

2.4.1Km值筛选 将乳化剂与助乳化剂按Km1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1振荡混匀后，再与油酸乙酯按Km1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1振荡混匀，固定体系总体积为1 mL，缓慢滴入水相，记录溶液由浑浊变为澄清时临界点的加水量[7]。采用Orgin 8.5软件绘制伪三元相图，以乳化剂、油相、水为3个顶点，确定成乳区域，结果见图1。

图1 伪三元相图

在低含水量、高表面活性剂的条件下，磁转子转动较缓慢，液体浓稠，颜色为黄色，不符合形成微乳的条件，经判断未成乳。随着加水量不断增加，溶液逐渐澄清透明，微泛蓝光，符合微乳的筛选条件，各区均延伸到水相顶点，即可被水无限稀释。滴入水相后，在不同Km下溶液颜色均澄清透明，颜色轻微泛蓝。图1中乳化区域影面积越大，乳化时间越短，代表成乳效果越好；Km为1∶2、1∶1时，乳化时间较长，故选择2∶1、3∶1、4∶1进行后续研究。

2.4.2 油相用量筛选 固定油相、乳化剂、助乳化剂体系1 mL，加入100倍纯化水，发现当油相用量小于10%时，形成的乳液为粗乳液，即表面有无法乳化的液滴，溶液颜色不澄清；当其用量大于50%时，有大量油滴悬浮在溶液中，难以形成微乳液。 因此，选择油相用量为10%～50%，此时可得到澄清透明、均一稳定的微乳液。

2.5 星点设计-效应面法 取自微乳适量，纯化水稀释100倍，采用粒径分析仪测定其粒径、Zeta电位；100 r/min进行磁力搅拌，测定乳化时间(溶液上层无油状漂浮物，比较澄清，微泛蓝光，即为完全乳化)。

在前期实验基础上，选择油相用量(X1)、乳化剂比例(X2)作为影响因素，平均粒径(Y1)、Zeta电位(Y2)、乳化时间(Y3)作为评价指标[8]，因素水平见表2，再采用Design Expert 8.0.6软件进行处方优化，结果见表3。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，结果见图2。由此可知，当Km保持中间水平不变时，随着油相用量增加，粒径、乳化时间均呈先降后升的趋势，而Zeta电位呈逐渐升高的趋势；当Km、油相用量最大时，粒径、Zeta电位、乳化时间均达到峰值。由于筛选自微乳处方时，应满足乳化后粒径小、Zeta电位绝对值高、乳化时间短的要求，故因素X1、X2最终取值分别为22.82、2.37，即最优处方为油酸乙酯用量22.82%，吐温80用量54.28%，聚乙二醇400用量22.90%。

表4 平均粒径方差分析

表5 Zeta电位方差分析

表6 乳化时间方差分析

图2 各评价指标响应面图

根据上述处方进行3批验证试验，结果见表7，可知实测值与预测值的偏差较小，表明该处方稳定可行，星点设计-效应面法预测结果良好。

表7 验证试验结果

2.7 自微乳质量评价

2.7.1 饱和载药量测定 按“2.6”项下最优处方制备自微乳1 mL，加入过量香叶木素原料药，超声处理2 h助溶，置于37 ℃恒温水浴振荡器中48 h，10 000 r/min离心10 min，上清液用甲醇稀释100倍，在343 nm波长处测定吸光度[9]，测得饱和载药量为(59.44±0.20)mg/mL。

2.7.2 溶解度测定 按“2.6”项下最优处方制备自微乳1 mL，加入纯化水稀释100倍，取2 mL至具塞管中，加入过量香叶木素原料药，混匀后涡旋5 min，按“2.2”项下方法测定溶解度。结果，自微乳在水中的溶解度为54.50 μg/mL，而原料药仅为1.05 μg/mL，即提高了52倍。

2.7.3 粒径、Zeta电位测定 制备自微乳适量，加入纯化水稀释100倍，采用激光粒度仪测定粒径、Zeta电位，结果见图3～4。由此可知，平均粒径为(17.46±0.29)nm，Zeta电位为(-22.67±0.15)mV，PDI为0.066±0.002，并且粒径较小，分布较集中。

图3 自微乳粒径分布

图4 自微乳Zeta电位

2.7.4 形态观察 取自微乳适量，在37 ℃水浴中用100倍纯化水稀释，轻微搅拌混合均匀，取少量至铜网上，静置5 min，滴加2%磷钨酸溶液负染5 min，滤纸吸去负染色液，室温晾干，在透射电子显微镜下观察形态，结果见图5。由此可知，乳滴粒径大小均一，分布均匀，无粘连。

2.7.5 稳定性研究 对自微乳进行温度稳定性(在4、25、60 ℃下避光保存)、强光照射稳定性[在25 ℃、(4 500±500)lx下保存][10]试验，于第0、5、10天观察外观，测定香叶木素含量，结果见表8～9。由此可知，在4、25 ℃下自微乳及其乳化后溶液澄清，香叶木素含量无明显变化，但在60 ℃下两者颜色变深，第5、10天时该成分含量分别降低11.24%、19.95%；在强光照射下，自微乳及其乳化后溶液澄清，但随着时间延长香叶木素含量也明显降低。综上所述，自微乳应低温避光保存。

图5 自微乳透射电镜图

表8 温度稳定性试验结果(n=3)

表9 强光照射稳定性试验结果(n=3)

2.7.6 体外溶出度研究 按“2.6”项下最优处方制备自微乳0.5 mL，并装入胶囊中，使其最终载药量为25 mg；另取香叶木素原料药25 mg，也装入胶囊中。采用2020年版《中国药典》四部通则0931溶出度测定法第一法(篮法)，以900 mL蒸馏水为溶出介质，设定水浴温度为37 ℃，转速为100 r/min，于1、2、5、10、20、30、45、60 min各取样5 mL(取样后及时补充溶出介质)，在343 nm波长处测定吸光度，计算累积溶出度[11-12]，结果见图6。由此可知，自微乳胶囊释药迅速完全，10 min内累积溶出度即达80%以上，而原料药胶囊释药缓慢，表明自微乳可有效提高药物溶出速度。

图6 香叶木素体外溶出曲线

3 讨论

自微乳释药系统是O/W型热力学稳定的油水混合系统，其中乳化剂的选择是自微乳处方关键，若其用量过多，则会对胃肠黏膜产生一定的刺激，引起胃肠道不适；用量过少，则药物进入胃肠道后乳化形成的乳滴粒径较大，对微乳稳定性产生影响。因此，乳化剂用量需适宜，并且尽可能选择毒性较低、同时乳化能力较高者[13]。

自微乳中油相能提高药物的溶解能力，促进药物乳化，同时还可刺激胃肠道产生脂蛋白和乳糜微粒，增加药物淋巴吸收途径及旁路转运，避免首过效应，间接提高药物生物利用度[14]。本实验筛选香叶木素自微乳处方，发现对该成分溶解度较大的油相有橄榄油和油酸乙酯，但与乳化剂、助乳化剂配伍时，后者能与吐温80、聚乙二醇400形成微乳，而前者无法乳化完全，溶液上层有油滴状漂浮物，并且乳化时间长。因此，选择油酸乙酯作为香叶木素自微乳油相。

星点设计是效应面法中最常用的一种优化方法，广泛应用于药剂学领域，它集数学、统计方法于一体，比常用均匀设计、正交试验更全面，实验精度更高，实验次数较少，能灵敏地反映各因素之间的交互作用，适用于多因素多水平实验，也是药物制剂处方工艺优化手段之一[15]。本实验针对难溶性天然黄酮类化合物香叶木素，采用星点设计-效应面法优化其自微乳处方，预测效果良好。

4 结论

本实验先通过测定溶解度、绘制伪三元相图，初步筛选香叶木素自微乳处方，再采用星点设计-效应面法对其进行优化。结果，所得自微乳加入水相后溶液呈淡黄色，表面无油滴漂浮，平均粒径为(17.46±0.29)nm，长时间放置性质稳定，与原料药比较，其药物溶解度与溶出速度显著提高，可为相关制剂研发提供参考，对水难溶性、脂溶性药物自微乳释药系统的研究也具有重要意义，具有一定的发展前景和应用价值。