苁蓉舒痉颗粒在正常与帕金森病大鼠中体内药动学的比较

2022-06-15刘秀棉洪丽婷熊朝栋余文静

中成药 2022年5期

刘秀棉，陈丹*，洪丽婷，熊朝栋，余文静，蔡晶

(1.福建中医药大学药学院，福建福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122)

帕金森病是一种因多巴胺能神经元变性引起的锥体外系疾病[1-2]，肌强直为其主要临床症状之一，中医药治疗本病时大多通过整体施治来改善临床症状，具有疗效确切、不良反应小等特点[3]。苁蓉舒痉方由酒苁蓉、酒黄精、丹参、赤芍、牡丹皮等药材组成，是源于经典方地黄饮子，结合实验和长期临床实践的有效方剂，课题组前期以此方为基础，研制出抗帕金森肌强直症的颗粒剂，松果菊苷、芍药苷、丹酚酸B、毛蕊花糖苷、丹参酮ⅡA等成分为该制剂特征效应组分群[4]。

在中药新药研究过程中，考察药效组分群的体内生物利用度[5-6]和血药浓度，了解它们在生物体内数量和质量的变化及药动学特性，对安全合理使用中药及正确评价其质量具有重要意义[7]。本实验比较苁蓉舒痉颗粒在正常与帕金森病大鼠中的体内药动学，筛选药代标示物，以期为科学制订该制剂质量标准、指导其临床合理用药奠定实验基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC TQD 超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，配置自动进样器、柱温箱、TQD检测器三重四级杆、ESI电离源、四元高压泵、在线脱气机、Masslynx4.1工作站控制系统(美国Waters公司)；TGL-18G-C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；SK-1快速混匀器(常州国华电器有限公司)；XS205电子天平[十万分之一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试剂与药物苁蓉舒痉颗粒(自制，批号20190411、20190412、20190413)；乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号20180831)。芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号B20771)；松果菊苷对照品(成都埃法生物科技有限公司，纯度>98%，批号AB0185-0020)；毛蕊花糖苷(批号S01675)、丹参酮ⅡA(批号S01209)、丹酚酸B(批号S01203)、芍药苷(批号S01794)对照品(南京狄尔格医药科技有限公司，纯度>98%)。甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；水为超纯水。

1.3 动物清洁级SD大鼠24只，雄性，体质量(250±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0005。大鼠在温度(22±2)℃、相对湿度(55±5)%的条件下适应性饲养7 d，自由进食饮水，保持室内自然通风，清洁级医学实验动物环境设施由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK(闽)2014-0005。大鼠处理方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》要求。

2 方法与结果

2.1 分组与造模 24只大鼠随机分为正常组和模型组，每组12只，正常组大鼠皮下注射葵花油乳化液(1.5 mg/kg)，每天1次，共14 d；模型组大鼠皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液(1.5 mg/kg)，每给药7 d休息1 d，共15 d。按表1评分标准[8]，发现14 d后模型组大鼠均出现2分及2分以上的行为学表现，提示造模成功。

表1 行为学评分标准

2.2 空白血浆制备取正常组、模型组大鼠各6只，禁食12 h，自由饮水，腹腔注射20%乌拉坦(5 mL/kg)麻醉，腹主动脉采血，血液置于预先肝素化的离心管中，室温静置30 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液，即得，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液精密称取松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品适量，50%甲醇超声溶解，制成分别含两者1.268、1.207 mg/mL的贮备液；精密称取芍药苷、丹参酮ⅡA对照品适量，甲醇超声溶解，制成分别含两者1.328、1.234 mg/mL的贮备液；精密称取丹酚酸B对照品适量，甲醇-水(8∶2)超声溶解，制成含1.282 mg/mL该成分的贮备液。取上述5种贮备液适量，50%甲醇制成分别含126 819 ng/mL松果菊苷、2 657 ng/mL芍药苷、2 563 ng/mL丹酚酸B、603.5 ng/mL毛蕊花糖苷、137.1 ng/mL丹参酮ⅡA的对照品溶液，置于4 ℃冰箱中贮存，临用前用甲醇稀释成所需质量浓度。

2.3.2 内标溶液精密称取芦丁对照品适量，置于100 mL量瓶中，甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得到贮备液(质量浓度0.305 mg/mL)，置于4 ℃冰箱中贮存，临用前取150 μL，甲醇稀释至100 mL，即得(每1 mL含457.5 ng芦丁)。

2.4 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～1.5 min，14%～30%A；1.5～3.0 min，30%～70%A；3.0～5.0 min，70%～90%A；5.0～6.0 min，90%A；6～6.1 min，90%～14%A；6.1～7.0 min，14%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.5 质谱条件电喷雾电离源(ESI)；毛细管电离电压3.5 kV；离子源温度110 ℃；去溶剂气N2，体积流量800 L/h，温度500 ℃；反吹气N2，体积流量50 L/h；碰撞气Ar，体积流量0.13 mL/min；质谱数据采集及处理软件采用Masslynx4.1工作站，多反应离子监测(MRM)模式，质谱参数见表2。

表2 各成分质谱参数

2.6 样品前处理取大鼠血浆200 μL，置于1.5 mL离心管中，加入内标溶液30 μL、6 mol/L甲酸50 μL、乙腈600 μL，涡旋混合2 min，17 000 r/min离心15 min，精密吸取上清液800 μL至另一离心管中，45 ℃氮气吹干，残留物加50%甲醇80 μL，涡旋复溶，17 000 r/min离心15 min，取上清液。

2.7 给药与取样取正常组、模型组大鼠各6只，给药前12 h禁食，自由饮水，灌胃给予等剂量颗粒混悬液(10 g/kg，生理盐水配制，用时温水浴加热至37 ℃)，给药后于0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36 h眼眶取血各约0.5 mL，置于预先肝素化的离心管中静置30 min，3 500 r/min离心10 min，取上层血浆，置于-20 ℃冰箱中贮存，待测。

2.8 方法学考察

2.8.1 专属性试验取正常组大鼠空白血浆、模型组大鼠空白血浆、正常组大鼠空白血浆加对照品、模型组大鼠空白血浆加对照品、给药后正常组大鼠血浆、给药后模型组大鼠血浆各200 μL，按“2.6”项下方法处理，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰与内标色谱峰分离度良好，内源性物质无干扰，表明该方法专属性良好。

2.8.2 线性关系考察精密吸取对照品溶液适量，甲醇稀释至系列质量浓度，分别精密吸取200 μL，置于1.5 mL离心管中，45 ℃氮气吹干，精密加入空白血浆200 μL，涡旋混合3 min，制得血浆对照品溶液，按“2.6”项下方法处理，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，对照品、内标峰面积比值为纵坐标(Y)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。再配制质量浓度处于标准曲线低浓度端的血浆对照品溶液，并逐渐稀释，平行5份，以S/N=10测定最低定量浓度，平行5次，以相对误差<20%、准确度在真实质量浓度80%～120%范围内的质量浓度为定量限，测得松果菊苷、毛蕊花糖苷、芍药苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA其数值分别为140.9、0.670 5、2.953、2.847、0.152 3 ng/mL，可满足检测要求。

a.松果菊苷 b.毛蕊花糖苷 c.内标(芦丁) d.芍药苷 e.丹酚酸B f.丹参酮ⅡAa.echinacoside b.acteoside c.internal standard(rutin) d.paeoniflorin e.salvianolic acid B f.tanshinone IIA图1 各成分MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

表3 各成分线性关系(n=7)

2.8.3 精密度试验精密吸取对照品溶液适量，按“2.8.2”项下方法处理，制备高、中、低质量浓度的含内标血浆对照品溶液，平行5份，同一天在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，计算日内精密度；连续测定3 d，每天1次，计算日间精密度。结果，各成分精密度RSD均小于11.0%，表明该方法精密度良好，符合生物样品分析要求。

2.8.4 方法回收率试验精密吸取对照品溶液适量，按“2.8.2”项下方法处理，制备高、中、低质量浓度的含内标血浆对照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，将测定值与对应质量浓度的理论值进行比较，计算方法回收率，结果见表4，可知该方法准确度良好，符合生物样品分析要求。

2.8.5 提取回收率试验精密吸取对照品溶液适量，按“2.8.2”项下方法处理，制备高、中、低质量浓度的含内标血浆对照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，得峰面积A；另取空白血浆，按“2.6”项下方法处理，加入对应质量浓度的含内标对照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，得峰面积B，计算提取回收率，公式为提取回收率=(A/B)×100%，结果见表4，可知该方法提取回收率良好，符合生物样品分析要求。

2.8.6 基质效应考察取正常组、模型组大鼠空白血浆，按“2.6”项下方法处理，制备高、中、低质量浓度的含内标对照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，得峰面积C；另取对应质量浓度的含内标对照品溶液，按“2.8.2”项下方法处理(以水代替空白血浆)，平行5份，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，得峰面积D，计算基质效应，公式为基质效应=(C/D)×100%，同法考察内标基质效应，结果见表4，可知各成分及内标无明显离子抑制或增强作用，内源性物质对测定无干扰，符合生物样品分析要求。

表4 各成分方法回收率、提取回收率、基质效应试验结果(n=5)

2.8.7 稳定性试验精密吸取对照品溶液适量，按“2.8.2”项下方法处理，制备高、中、低质量浓度的含内标血浆对照品溶液，平行5份，在“2.4”“2.5”项条件下进样测定，分别考察室温放置(8 h)、反复冻融(1周内进行5次)、长期冻融(在-20 ℃下保存15 d)时的稳定性，结果见表5，可知各成分在不同条件下均呈现良好的稳定性。

表5 各成分稳定性试验结果(n=5)

2.9 体内药动学研究采用DAS 2.0软件处理药动学数据，并通过非房室模型进行分析，结果见表6、图2。由此可知，给药后模型组芍药苷Tmax短于正常组，其他成分均保持不变；各成分血药浓度均在0.25 h达到最高，AUC均高于正常组；毛蕊花糖苷Cmax低于正常组，其他成分均高于正常组，提示在帕金森病状态下苁蓉舒痉颗粒口服吸收后进入体循环的相对量更高，以丹酚酸B更明显，而毛蕊花糖苷在不同生理状态下的差异较小；各成分t1/2均短于正常组，以丹酚酸B更明显；松果菊苷、丹酚酸B MRT短于正常组，芍药苷、丹参酮ⅡA更长，而毛蕊花糖苷无明显变化；各成分消除速度快于正常组，以丹酚酸B更明显，提示在帕金森病状态下苁蓉舒痉颗粒效应组分群的半衰期缩短，消除速度提升，其原因可能是发病时产生相应的应激内源性物质，提高细胞色素P450活性[9-11]，从而促进特征效应组分群的代谢和消除。

综上所述，苁蓉舒痉颗粒的药动学标志物是松果菊苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹酚酸B、丹参酮ⅡA，即为体内外共有组分群中的特征效应组分，并且在帕金森病状态下口服吸收后其血药浓度、Cmax、生物利用度明显提高，从而发挥更好的作用。

3 讨论

预实验筛选去蛋白方法时发现，溶剂沉淀法效果较优。再比较了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶2)，发现乙腈去除蛋白较彻底，而且样品回收率较高，故以其为蛋白沉淀溶剂。

结果显示，苁蓉舒痉颗粒特征效应组分群在帕金森病大鼠中的药动学产生一定变化，血药浓度、达峰浓度、口服生物利用度升高，并且正常与帕金森病大鼠血浆中各成分吸收峰均呈单一峰。由于药物口服生物利用度决定于胃肠道吸收量，而肠道转运蛋白和代谢酶又是决定药物胃肠道吸收的重要因素，故肠道菌群的改变会导致药物在体内代谢产物、代谢途径甚至药动学特征发生改变。文献[12]报道，帕金森病小鼠肠道微生物呈现紊乱状态，肠杆菌科细菌(如毛螺旋菌科、腔隙杆菌属等)数量显著增多；患者肠道中α-突触核蛋白累积[13-14]会导致肠黏膜屏障通透性增加[15]。由此推测，在帕金森病状态下可能由于小肠绒毛上皮细胞屏障通透性增加，肠道酶菌群系统排斥作用减弱，可提高苁蓉舒痉颗粒中效应组分群的吸收，从而使该制剂能更好地发挥药效。