黑木耳多糖的降解及其产物抗氧化性

曹慧馨，吴迪，王旭升，白洋，吴琼*，代永刚

（1.长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022；2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130022）

黑木耳多糖（Auricularia auricula polysaccharide，AAP）是黑木耳的主要生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等多种生理活性[2]。然而天然黑木耳多糖由于分子量大，黏度高、水溶性差，难以穿透多个细胞膜屏障，无法进入生物体内发挥功能活性[3]，因此，降解黑木耳多糖，制备低分子量多糖，对提高黑木耳多糖生物活性有重要意义。

降解多糖主要有酶降解法[4-5]、超声波辅助降解法、化学降解法[6]，其中化学降解包括氧化、酸、碱降解。碱降解会使多糖糖链中官能团遭到一定程度的破坏，影响多糖抗氧化活性，而氧化降解法中氧化剂对抗氧化活性的影响较大。本研究利用三氟乙酸优化黑木耳多糖降解工艺，以降解黑木耳多糖抗氧化活性为指标[7]探究三氟乙酸降解黑木耳多糖条件，得到三氟乙酸降解黑木耳多糖（degradation of Auricularia auricula polysaccharide by trifluoroacetic acid，T-DAAP），以期为分子修饰黑木耳多糖提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳：市售；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三氟乙酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；UV-2700型紫外可见分光光度计：日本岛津仪器有限责任公司；NTS-4000B型恒温振荡水槽：日本东京理化器械株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖的提取

采用水提醇沉法[8]提取黑木耳多糖。

1.3.2 多糖的降解

1.3.2.1 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）降解黑木耳多糖单因素试验

以DPPH自由基清除率为指标，进行单因素试验。5 mg/mL黑木耳多糖溶液于不同三氟乙酸浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mol/L）、不同反应时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、不同反应温度（40、50、60、70、80、90 ℃）下进行水解反应。

1.3.2.2 黑木耳多糖降解条件的优化

响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应因子与水平Table 1 Response factor and level

1.3.3 黑木耳降解多糖的制备

降解多糖由黑木耳多糖在1.3.2.2优化得到的条件下降解，经减压浓缩、透析纯化等过程制备。

1.3.4 AAP和T-DAAP组成及结构分析

采用苯酚-硫酸法[10]、考马斯亮蓝法[11]、间羟基联苯法[12]测定多糖中总糖、蛋白及糖醛酸含量；按GB 5009.4—2016[13]测定灰分含量；参照陆娟等[14]多糖溶解度测定方法；采用高效凝胶渗透色谱测定多糖分子量[15]；采用傅里叶红外光谱扫描特征吸收峰[16]；采用高效液相色谱测定多糖单糖组成[17]。

1.3.5 体外抗氧化试验

1.3.5.1 黑木耳降解多糖的DPPH自由基清除试验

2mL样品加入2mLDPPH-乙醇溶液（0.1mmol/L），摇匀并避光反应30 min后测定517 nm处吸光度[9]。抗坏血酸（VC）做阳性对照，平行试验3次。计算公式如下。

式中：A1为样品与DPPH-乙醇溶液测得的吸光度；A2为样品与乙醇测得的吸光度；A0为蒸馏水与DPPH-乙醇溶液测得的吸光度。

1.3.5.2 羟基自由基清除试验

1 mL样品加入等量6 mmol/L硫酸亚铁溶液、6 mmol/L H2O2溶液、6 mmol/L水杨酸溶液，避光反应30 min后于517 nm处测吸光度[18]。以抗坏血酸做为对照，按下式计算清除率。

式中：A1为样品与硫酸亚铁溶液、H2O2溶液、水杨酸溶液测得吸光度；A2为蒸馏水代替H2O2溶液测得吸光度；A0为蒸馏水代替多糖样品测得吸光度。

1.3.5.3 超氧阴离子自由基清除试验

向15 mL离心管中加入样品、300 μmol/L氯化硝基四氮唑蓝溶液、936 μmol/L烟酰胺腺嘌呤溶液和120 μmol/L 5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液各1 mL，避光反应30 min，在570 nm处测吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，按下式计算清除率。

式中：A1为样品与氯化硝基四氮唑蓝溶液、烟酰胺腺嘌呤溶液、5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液测得吸光度；A2为蒸馏水代替5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液测得吸光度；A0为蒸馏水代替多糖样品测得吸光度。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Execl 2016进行处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 TFA浓度对DPPH自由基的清除活性的影响

不同浓度TFA对DPPH自由基的清除率，试验结果见图1。

图1 TFA浓度对DPPH自由基清除活性的影响Fig.1 Effect of concentration of TFA on DPPH radical scavenging activity

由图1可知，TFA浓度在0.2 mol/L～0.8 mol/L，降解多糖对DPPH自由基的清除率随降解剂浓度升高呈不断上升趋势，浓度达0.8 mol/L后，降解多糖DPPH自由基清除率不断下降，这可能是由于高浓度TFA促使黑木耳多糖降解成更小的结构，黑木耳多糖活性官能团遭到破坏，导致DPPH自由基清除活性随浓度升高降低[19]。

2.1.2 反应时间对DPPH自由基清除活性的影响

反应时间对DPPH清除活性的影响见图2。

图2 反应时间对DPPH自由基清除活性的影响Fig.2 Effect of reaction time on DPPH radical scavenging activity

由图2可知，当反应时间由0.5 h延长至2.0 h时，降解多糖对DPPH自由基的清除率由32.23%增加到75.88%，2.0 h后缓慢降低，这可能是因为较长时间的降解反应加剧多糖降解[20]。

2.1.3 反应温度对DPPH自由基清除活性的影响

反应温度对DPPH自由基清除活性的影响见图3。

图3 反应温度对DPPH自由基清除活性的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on DPPH radical scavenging activity

由图3可见，黑木耳降解多糖对DPPH的清除率在40℃到80℃之间不断增加，而温度超过80℃时出现转折。这可能是由于温度的升高导致分子运动加剧，反应加速，当温度超过80℃，多糖降解程度增大，大量的单糖随之产生，使具有DPPH自由基清除活性的低分子量多糖结构被破坏，DPPH自由基清除率有所降低。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面分析方案与试验结果

根据上述试验结果，选取TFA浓度（A）、反应时间（B）、反应温度（C）作为自变量，在降解多糖浓度为2 mg/mL时对DPPH自由基清除率（Y）作为响应值，用Design Expert软件进行响应面分析，采用Box-Bohnken中心组合设计降解反应条件，结果见表2。

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

续表2 响应面分析方案与试验结果Continue table 2 Response surface analysis scheme and test results

采用Design Expert软件对表2试验结果进行二次回归分析，得到回归方程Y（DPPH自由基清除率/%）=71.82+0.29A+1.67B-2.71C+0.56AB+3.44AC+0.17BC-2.14A2-3.80B2-8.02C2。

方差分析见表3。

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项差异不显著。相关系数R2为0.940 9，试验模型的校正系数R2Adj=0.8648，表明试验数据较可靠，该模型拟合度较高，可以用于降解多糖DPPH自由基清除率的理论预测。C、B2、C2影响极显著（P＜0.01），AC 影响显著（P＜0.05）。

根据Design-Expert软件分析试验数据可以得出当TFA浓度为0.79 mol/L、反应时间为2.11 h、反应温度为78.23℃时，DPPH自由基清除率72.23%，此时为最优的降解条件。

2.2.2 交互作用对响应值的影响

各因素交互作用对降解多糖DPPH自由基清除率的影响见图4。

图4 各因素交互作用对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of interaction of various factors on DPPH radical scavenging rate

响应面坡度越陡峭，表明该交互作用对DPPH自由基清除率的影响越大；反之则表明交互作用对DPPH自由基清除率的影响越小。在交互项对提取率的影响中，TFA浓度与反应温度交互作用明显，与方差分析的结果一致。

通过上述试验可知，黑木耳多糖的TFA浓度0.79 mol/L、反应时间2.11 h和反应温度78.23℃，2 mg/mL降解多糖对DPPH自由基清除率的理论值为72.23%。考虑可行性，调整试验条件为78.2℃下0.8 mol/L TFA降解反应2.1 h，得到黑木耳降解多糖对DPPH自由基的清除率为70.37%，此值与理论值较为接近，所以对在此条件下得到的黑木耳降解多糖进行后续研究。

2.3 黑木耳多糖和降解多糖的组成及溶解度分析

AAP和T-DAAP的主要成分及溶解度见表4。

表4 AAP和T-DAAP的主要成分及溶解度Table 4 Main components and solubility of AAP and T-DAAP%

降解后多糖的总糖、糖醛酸含量略有降低，蛋白质和灰分含量有所升高，这可能是由于三氟乙酸降解后产生部分单糖被透析除去所导致的。多糖溶解度从（38.00±0.30）mg/mL 提升至（51.00±0.20）mg/mL，说明黑木耳多糖降解成小分子能够有效提高其溶解度。

2.4 黑木耳多糖和降解多糖分子量分布

黑木耳多糖和降解多糖分子量分布见图5。由图5所示，AAP的保留时间为9.721 min，T-DAAP的保留时间为11.009 min，计算得出AAP分子量为148.2 kDa，T-DAAP分子量为37.5 kDa，说明三氟乙酸能够有效降解黑木耳多糖。

图5 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution

2.5 黑木耳多糖和黑木耳降解多糖红外光谱扫描结果

图6为AAP和T-DAAP的红外光谱扫描结果。

图6 红外光谱扫描结果Fig.6 Infrared spectrum scanning results

从图6发现二者谱图均有多糖类物质的特征吸收峰，3 400 cm-1附近为羟基键伸缩振动吸收峰，2 932 cm-1附近为甲基或次甲基的C-H键伸缩振动吸收峰[17]。此外，C=O的非对称伸缩振动吸收峰在1 630 cm-1处，CH的变形振动吸收峰1 420 cm-1附近，β-糖苷键的特征峰在900 cm-1附近[20]。说明降解没有改变多糖基本结构。

2.6 黑木耳多糖和降解多糖单糖组成

AAP和T-DAAP单糖含量见表5。

表5 AAP和T-DAAP单糖组成Table 5 Monosaccharide composition of AAP and T-DAAP

由表5可知，AAP和T-DAAP主要由甘露糖、葡萄糖和少量的葡萄糖醛酸等组成，降解只改变多糖分子量，其单糖组成及含量未发生改变。

2.7 体外抗氧化试验

不同浓度样品对DPPH自由基清除率的影响见图7，不同浓度样品对羟基自由基清除率的影响见图8，不同浓度样品对超氧阴离子自由基清除率的影响见图9。

图7 不同浓度样品对DPPH自由基清除率的影响Fig.7 Effects of different concentrations of samples on DPPH free radical scavenging

图8 不同浓度样品对羟基自由基的影响Fig.8 Effects of different concentrations of samples on hydroxyl radical

图9 不同浓度样品对超氧阴离子自由基的影响Fig.9 Effects of different concentrations of samples on superoxide anion radical

由图7～图9可知，抗坏血酸、AAP、T-DAAP对DPPH自由基均有清除能力，且T-DAAP清除效果明显高于AAP。在浓度为10 mg/mL时，T-DAAP的清除效果与抗环血酸相近，高达95.39%，这可能是由于降解使AAP的活性基团暴露，提高黑木耳降解多糖清除能力；T-DAAP对羟基自由基清除能力不及VC，但相比AAP对羟基自由基清除能力有所提高，且随着浓度升高而提升，在浓度为10 mg/mL时，清除率达36.49%；同浓度下超氧阴离子自由基清除率VC＞TDAAP＞AAP，且随着浓度的升高而升高，在T-DAAP浓度为10 mg/mL时，清除率达66.33%。

3 结论

试验优化了三氟乙酸水解黑木耳多糖工艺。结果表明，三氟乙酸水解黑木耳多糖的最优条件为TFA浓度0.8 mol/L、温度78.2℃、降解2.1 h，T-DAAP的DPPH自由基清除率为70.37%。降解后多糖溶解度从（38±0.30）%提升至（51±0.20）%，分子量分由 148.2 kDa降低至37.5 kDa，红外光谱扫描发现降解未破坏多糖特征官能团。T-DAAP的DPPH自由基、羟基自由基清除活性明显优于AAP，表明T-DAAP生物活性得到提高，为黑木耳多糖的分子修饰提供试验基础。