余甘子干鲜品化学成分比较

邓桂珠， 甘国兴， 李 炜， 向燕芬， 龙国斌， 卢 泳， 吴茂勇， 朱卫星*

(1.广东省鲜药民族医药工程技术研究中心，广东 清远 511500；2.清远市中医院药学部，广东 清远 511500)

余甘子系藏族习用药材，为大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果实，其味甘、酸、涩，性凉，归肺、胃经，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳的功效[1]，是药食同源药材[2]，富含鞣质、维生素C、黄酮、氨基酸、蛋白质、多糖等成分。研究表明，余甘子新鲜果实中单宁含量高达45%，干燥果实中也有14%[3-4]，营养价值高[5]，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗肿瘤、抗突变、降血脂、降血压、抑菌、保肝等药理作用[6-12]。

目前，临床应用余甘子以干品为主，而岭南民间习用鲜品[13-14]，历史悠久[15]。但对余甘子研究主要集中于药学、药理作用、临床应用等方面，对鲜品涉及极少，干鲜品化学成分的差异也鲜有报道。在治疗疾病的过程中，中医传统上使用鲜药，往往具有独特的或是比干品更显著的效果[16]。

本研究对余甘子干鲜品的黄酮、鞣质部位进行HPLC指纹图谱研究，并对总鞣质、总黄酮、没食子酸、芦丁含量进行测定，以期为其后续临床应用及药理药效考察提供参考。

1 材料

Waters 2695型高效液相色谱系统(美国沃特世公司，配置Waters 2489型紫外检测器、Empower工作站)；Aglient ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；U-2910型紫外-分光光度计(天美科技有限公司)；XS205型电子天平[十万分之一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；DFY-500D 500 g摇摆式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；KH-100A型电热鼓风干燥箱(上海恒科学仪器有限公司)；SP-100A型超声波清洗器(洁康超声波仪器设备有限公司)；XMTD-7000型水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度91.5%)；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，供HPLC法测定，纯度91.7%；供UV法测定，纯度92.4%)。乙腈、甲醇、磷酸、冰乙酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为屈臣氏水。

10批余甘子从广东、云南、福建采收，经清远市中医院药学部朱卫星主任鉴定为大戟科余甘子PhyllanthusemblicaL.的果实。鲜品按照《广东省中药材标准》第一册[15]处理(抹去表面水分，除去果核，用非铁质刀具切细)，干品是将切细后的鲜品置于60 ℃电热鼓风干燥箱中干燥制成，水分符合2020年版《中国药典》要求，具体信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 总鞣质含量测定 参照2020年版《中国药典》第四部总鞣质含量测定方法。

2.1.1 对照品溶液制备和线性关系考察 精密称取没食子酸对照品适量，20%乙醇稀释至刻度，制成质量浓度为43 μg/mL的贮备液。精密量取1、2、3、4、5、6 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水11、10、9、8、7、6 mL，29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在760 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=0.088 2X+0.060 5(r=0.999 8)。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称定药材粉末1 g(过3号筛)，置于100 mL棕色量瓶中，加乙醇浸泡，超声处理后放冷，乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液50 mL，精密量取续滤液5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，20%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 提取方法优化 通过单因素试验，分别对乙醇体积分数、料液比、提取时间、浸泡时间进行考察，同时采用L9(34)正交试验，获得最佳提取方法为加入20%乙醇浸泡30 min(料液比1∶50)，超声处理60 min。

2.1.4 结果分析 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定10批干鲜品总鞣质含量。结果，鲜品总鞣质含量范围为4.13%～9.55%，干品总鞣质为2.99%～8.69%，以云南产地最高，并且鲜品高于干品，见图1。

图1 余甘子干鲜品总鞣质含量比较Fig.1 Comparison of the contents of total tannins between fresh and dry P. emblica

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 操作 参照2020年版《中国药典》第四部紫外-分光光度法，以芦丁质量浓度为横坐标(X)，510 nm波长处吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=7.634 7X+0.018 2(r=0.999 9)。样品经适当稀释后取2 mL，加入4 mL水、1 mL 5%亚硝酸钠溶液摇匀，静置6 min，加入1 mL 10%硝酸铝摇匀，静置6 min，加入6 mL 10%氢氧化钠摇匀，加水定容至20 mL棕色量瓶中，静置15 min后测定吸光度，计算总黄酮提取率。

2.2.2 总黄酮提取方法优化 通过单因素试验，对乙醇体积分数、料液比、提取时间、温度进行考察，同时采用L9(34)正交试验，获得最佳提取方法为加入60%乙醇后70 ℃水浴(料液比1∶60)，超声处理20 min。

2.2.3 结果分析 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下方法测定10 批余甘子干鲜品总黄酮含量。结果，鲜品总黄酮含量范围为1.54%～6.01%，干品总黄酮为1.91%～7.03%，以云南产地最高，并且鲜品低于干品，见图2。

图2 余甘子干鲜品总黄酮含量比较Fig.2 Comparison of the contents of total flavonoids between fresh and dry P. emblica

2.3 鞣质部位HPLC指纹图谱建立

2.3.1 色谱条件 Aglient ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱(0～4 min，体积流量1.0 mL/min，5%A；4～4.01 min，体积流量1.0～0.3 mL/min，5%A，4.01～30 min，体积流量0.3 mL/min，5%A；30～35 min，体积流量0.3～mL/min，5%A；35～35.01 min，体积流量0.5～1.0 mL/min，5%A；35.01～40 min，体积流量1.0 mL/min，5%～20%A)；柱温25 ℃；检测波长260 nm；进样量5 μL。

2.3.2 溶液制备

2.3.2.1 对照品 精密称取没食子酸对照品适量，加20%乙醇制成质量浓度为43 μg/mL的溶液，即得。

2.3.2.2 HPD100大孔树脂预处理 称取30 g大孔树脂，加入95%乙醇没过液面浸泡24 h，再用水浸泡4 h，上样前用200 mL水冲洗柱子。

2.3.2.3 干品供试品 按“2.1.3”项下方法提取，精密称取药材粉末(过3号筛)1.0 g，加入20%乙醇50 mL，置于100 mL棕色量瓶中浸泡30 min，50 ℃水浴超声提取60 min，放冷，20%乙醇定容至刻度，滤过，滤液水浴蒸干，蒸干后的残渣用10 mL水溶解，加到处理好的大孔树脂中，静置20 min后用90 mL水冲洗柱子，收集洗脱液，置于水浴锅中蒸干，残渣用20%乙醇溶解，定容于25 mL量瓶中，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，即得，进样前过0.45 μm微孔滤膜。

2.3.2.4 鲜品供试品 鲜品切制小块，按表1干鲜品兑换比精密称取适量，研磨成浆，剩余步骤同“2.3.2.3”项，即得。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.3.2 重复性试验 取同一批样品(编号G6)过3号筛，按“2.3.2”项下方法制备干品供试品溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.3.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于4、8、12、16、20、24 h在“2.3.1”项条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于2%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.4 图谱生成 取对照品溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，获得色谱图；将10批干鲜品按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项条件下进样测定，获得色谱图。将相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012A版)，采用平均数法和多点矫正法，时间宽度0.1 min，生成相应的对照指纹图谱，以没食子酸为参照，10批干鲜品各标定了5 个共有峰，但峰面积有差异，见图3～4；鲜品相似度大于0.840 0，干品相似度大于0.770 0，表明各批样品之间存在差异，可能与采收时间和产地来源有关。

图3 10 批余甘子鲜品鞣质部位指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of tannin fraction of ten batches of fresh P. emblica

2.4 黄酮部位HPLC指纹图谱建立

2.4.1 色谱条件 Aglient ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，10%～16%A；20～40 min，16%～18%A；40～45 min，18%～40%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长360 nm；进样量10 μL。

图4 10 批余甘子干品鞣质部位指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprints of tannin fraction of ten batches of dry P. emblica

2.4.2 溶液制备

2.4.2.1 对照品 精密称取芦丁对照品适量，60%乙醇制成质量浓度为59.26 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2.2 干品供试品 精密称取药材粉末(过3号筛)1.0 g，加入60%乙醇60 mL，称定质量，70 ℃水浴超声处理20 min，放冷，60%乙醇补足减失质量，滤过，滤液水浴蒸干，残渣用60%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，即得，进样前过0.45 μm微孔滤膜。

2.4.2.3 鲜品供试品 鲜品切制小块，按表1干鲜品兑换比精密称取适量，研磨成浆，剩余步骤同“2.4.2.2”项，即得。

2.4.3 方法学考察

2.4.3.1 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.4.1”项条件下进样测定6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3.2 重复性试验 取同一批样品(编号G6)过3号筛，按“2.4.2”项下方法制备干品供试品溶液，在“2.4.1”项条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.3.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于4、8、12、16、20、24 h在“2.4.1”项条件下进样测定，测得各色谱峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4 图谱生成 取对照品溶液，在“2.4.1”项条件下进样测定，获得色谱图；将10批干鲜品按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”项条件下进样测定，获得色谱图。将相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，采用平均数法和多点矫正法，时间宽度0.1 min，生成相应对照指纹图谱，以峰面积最大的芦丁为参照，鲜品共有峰有7个，干品共有峰有10个。将干鲜品指纹图谱的共有模式进行对比，发现两者共有峰为7 个(1～7号峰)，峰面积和数量均不同，表明化学成分存在差异，见图5～7。同时，测得各批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.85，表明它们之间存在差异，可能与采收时间和产地来源有关。

图5 10批余甘子鲜品黄酮部位指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprints of flavanoid fraction of ten batches of fresh P. emblica

图6 10批余甘子干品黄酮部位指纹图谱Fig.6 HPLC fingerprints of flavanoid fraction of ten batches of dry P. emblica

注：X为余甘子鲜品共有指纹图谱，G为余甘子干品共有指纹图谱。图7 余甘子干鲜品指纹图谱共有模式Fig.7 Common patterns of fingerprints for dry and fresh P. emblica

2.5 没食子酸含量测定

2.5.1 色谱条件 Aglient ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱(0～4 min，体积流量1.0 mL/min,5%A；4～4.01 min，体积流量1.0～0.3 mL/min，5%A；4.01～15 min，体积流量0.3 mL/min，5%A；15～17 min，体积流量0.3～1.0 mL/min，5%～20%A；17～23 min，体积流量1.0 mL/min，20%～5%A)；柱温25 ℃；检测波长273 nm；进样量10 μL。

2.5.2 溶液制备

2.5.2.1 对照品 精密称取没食子酸对照品适量，20%乙醇稀释至刻度，制成质量浓度为98.4 μg/mL的溶液，即得。

2.5.2.2 干品供试品 按“2.1.3”项下方法提取，精密称取药材粉末(过3号筛)1.0 g，加入20%乙醇50 mL，置于100 mL棕色量瓶中浸泡30 min，50 ℃水浴超声提取60 min，放冷，20%乙醇定容至刻度，滤过，取续滤液，即得，进样前过0.45 μm微孔滤膜。

2.5.2.3 鲜品供试品溶液 鲜品切制小块，按表1兑换比精密称取适量，研磨成浆，剩余步骤同“2.5.2.2”项，即得，色谱图见图8。

注：S1为对照品图谱，S2为样品图谱。1.没食子酸1.gallic acid图8 余甘子HPLC色谱图(Ⅰ)Fig.8 HPLC chromatogram of P. emblica(Ⅰ)

2.5.3 方法学考察

2.5.3.1 线性关系考察 精密量取“2.5.2”项下对照品溶液1、2、3、4、5、6、7、8 mL，置于10 mL量瓶中定容，过0.45 μm微孔滤膜，吸取10 μL，在“2.5.1”项条件下进样测定。以没食子酸进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=107 205X-231 130(r=0.999 6)，在0.09～0.72 μg范围内线性关系良好。

2.5.3.2 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.5.1”项条件下进样测定6次，测得没食子酸峰面积RSD为1.97%，表明仪器精密度良好。

2.5.3.3 重复性试验 取同一批样品(编号G6)过3号筛，按“2.5.2”项下方法制备干品供试品溶液，在“2.5.1”项条件下进样测定，测得没食子酸含量RSD为1.85%，表明该方法重复性良好。

2.5.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.5.1”项条件下进样测定，测得没食子酸含量RSD为1.35%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.3.5 加样回收率试验 精密称取药材(编号G6)9份，按高、中、低水平加入对照品溶液，平行3份，按“2.5.2”项下方法制备干品供试品溶液，在“2.5.1”项条件下进样测定，测得没食子酸平均加样回收率为100.19%，RSD为1.37%。

2.5.4 样品含量测定 精密称定10批干鲜品，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项条件下进样测定，计算含量。结果，鲜品没食子酸含量范围为0.062%～0.427%，干品没食子酸为0.064%～0.691%，以云南产地最高，并且鲜品低于干品，见图9。

图9 余甘子干鲜品没食子酸含量比较Fig.9 Comparison of the contents of gallic acid between fresh and dry P. emblica

2.6 芦丁含量测定

2.6.1 色谱条件 Aglient ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～35 min，10%～18%A；35～40 min，18%～10%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长360 nm；进样量10 μL。

2.6.2 溶液制备

2.6.2.1 对照品 精密称取芦丁对照品适量，60%乙醇制成质量浓度为0.215 4 mg/mL的溶液，即得。

2.6.2.2 干品供试品 精密称取药材粉末(过3号筛)1.0 g，加入60%乙醇60 mL，称定质量，70 ℃水浴超声处理20 min，放冷，60%乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得，进样前过0.45 μm微孔滤膜。

2.6.2.3 鲜品供试品溶液 鲜品切制小块，按表1兑换比精密称取适量，研磨成浆，剩余步骤同“2.6.2.2”项，即得，色谱图见图10。

注：L1为对照品，L2为鲜品。1.芦丁1.rutin图10 余甘子HPLC色谱图(Ⅱ)Fig.10 Liquid spectrum of P. emblica(Ⅱ)

2.6.3 方法学考察

2.6.3.1 线性关系考察 精密量取“2.6.2”项下对照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，置于10 mL量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜，吸取10 μL，在“2.6.1”项条件下进样测定。以芦丁进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=16 445X+153 445(r=1.000 0)，在0.20～1.38 μg范围内线性关系良好。

2.6.3.2 精密度试验 取同一份对照品溶液，在“2.6.1”项条件下进样测定6次，测得芦丁峰面积RSD为0.64%，表明仪器精密度良好。

2.6.3.3 重复性试验 取同一批样品(编号G6)过3号筛，按“2.6.2”项下方法制备干品供试品溶液，在“2.6.1”项条件下进样测定，测得芦丁含量RSD为2.76%，表明该方法重复性良好。

2.6.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于4、8、12、16、20、24 h在“2.6.1”项条件下进样测定，测得芦丁含量RSD为2.45%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.3.5 加样回收率试验 精密称取样品(编号G6)9 份，按高、中、低水平加入对照品溶液，按“2.6.2”项下方法制备干品供试品溶液，平行3份，在“2.6.1”项条件下进样测定，测得芦丁平均加样回收率为99.09%，RSD为1.86%。

2.6.4 样品含量测定 精密称定10 批干鲜品，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.6.1”项条件下进样测定，计算含量。结果，鲜品芦丁含量范围为0.05%～0.10%，干品为0.22%～0.49%，3个产地相当，并且鲜品低于干品，见图11。

图11 余甘子干鲜品芦丁含量比较Fig.11 Comparison of the contents of rutin between fresh and dryP. emblica

3 讨论

中药在临床使用中，常有干品、熟品、鲜品之分，鲜品即鲜药材，也称鲜药，是指未经干燥及加工处理的、具有治疗疾病或保健作用的新鲜植物药、动物药、菌类药，是针对干药材而言[17]。鲜药是传统中医临床上的特色用药之一，具有悠久的历史，在两千多种常用中草药中以其为主的高达486种[18]。余甘子被国家卫生部列入“既是食品又是药品”的名单，也被世界卫生组织指定为在全世界推广种植的三大保健植物之一，开发潜力巨大。

余甘子干鲜品均具有清热凉血、消食健脾、生津止咳的功效，中医认为鲜品在清热凉血、生津方面上较干品更优。本研究发现，余甘子鲜品总鞣质含量显著高于干品，推测前者上述功效优于后者可能与此有关；在余甘子干鲜品鞣质部位HPLC指纹图谱中，鲜品鞣质部位1、2号峰的峰面积高于干品，进一步印证了这一点。

另外，余甘子干品总黄酮、芦丁、没食子酸含量均高于鲜品，推测前者消食健胃功效优于后者可能与此有关；干品HPLC指纹图谱的共有峰数量比鲜品多，峰面积也有差异，进一步印证了这一点。

综上所述，余甘子干鲜品化学成分的差异与其中医临床应用的不同有一定联系，但后期仍需继续对其进行药效学验证。