山菅兰根化学成分及其对OVCaR-3细胞增殖的影响

2022-06-14李凯歌张明霞

中成药 2022年4期

李凯歌，张明霞

(平顶山学院医学院，河南平顶山 467000)

山菅兰根为百合科山菅兰属植物山菅兰Dianellaensifolia(L.)DC.的根，主要分布于浙江、广州、河南、湖北等地[1]，其性凉，味甘辛，具有拔毒消肿的功效，外用治痈疮脓肿、癣、淋巴结结核、淋巴结炎。现代药理作用表明，山菅兰具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老等作用[2]，其化学成分主要包括黄酮类、香豆素类、有机酸类、三萜类、挥发油类、甾萜类、糖类等[3]，但相关报道较少。本实验对山菅兰根化学成分进行研究，共鉴定出14个化合物，均为首次从该植物中分离得到，其中化合物7、11对OVCaR-3细胞增殖具有一定的抑制作用。

1 材料

AV500-Ⅲ型超导核磁共振仪(德国 Bruker公司)；Trap-SL1100型质谱仪(美国Agilent公司)；柱色谱硅胶(100～200、300～400目，青岛海洋化工厂有限公司)；UV-3000型暗箱式紫外分析仪(上海越众仪器设备有限公司)；SephadeX LH-20凝胶(瑞典Pharmacia公司)；RFK51T型旋转蒸发仪(上海贤德实验仪器有限公司)；PLY412型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；MNTR45型电子天平(北京华衡科技有限公司)；NBT361型全自动转子离心机(上海赵迪生物科技有限公司)；HBS-ScanX型全自动多功能酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，德国Biofroxx公司)；噻唑蓝(MTT，上海源叶生物科技有限公司)；5-氟尿嘧啶(上海沪鼎生物科技有限公司)。人卵巢癌细胞株OVCaR-3(中国科学院上海生命科学研究院)。所用试剂均为分析纯。

山菅兰根采自河南省平顶山市，经平顶山学院夏西超教授鉴定为山菅兰Dianellaensifolia(L.)DC.的根。

2 提取与分离

取干燥的山菅兰根30.6 kg，粉碎后经95%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏3.2 kg，超声分散于水中，依次采用石油醚、二氯甲烷、丙酮、正丁醇萃取，减压浓缩得石油醚部分浸膏212.4 g、二氯甲烷部分浸膏241.3 g、丙酮部分浸膏186.2 g、正丁醇部分浸膏204.1 g。取二氯甲烷部分，经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20～40∶60～20∶80)梯度洗脱，得到8个流分Fr.B1～Fr.B8，Fr.B3(9.5 g) 经硅胶柱，以石油醚-丙酮(90∶10～70∶30～30∶70～10∶90)梯度洗脱，得到9个组分Fr.B3-1～Fr.B3-9，Fr.B3-4(754 mg) 经硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20)洗脱，得化合物11(18 mg)；Fr.B3-6(976 mg) 经硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(60∶40)洗脱，得化合物3(25 mg)、7(29 mg)；Fr.B3-7(1 158 g) 经硅胶柱，以石油醚-丙酮(60∶40)洗脱，得化合物6(31 mg)、10(27 mg)；Fr.B3-9(761 g) 经Sephadex LH-20柱，以甲醇进行洗脱，得化合物1(22 mg)、14(19 mg)。取丙酮部分浸膏，经硅胶柱分离，以二氯甲烷-乙酸乙酯(85∶15～65∶45～45∶65～15∶85)梯度洗脱，得到8个流分Fr.C1～Fr.C8，Fr.C2(11.2 g) 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-正丁醇(85∶15～65∶45～45∶65～15∶85)梯度洗脱，得到7个组分Fr.C4-1～Fr.C4-7，Fr.C4-2(759 g) 经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-正丁醇(80∶20) 进行洗脱，得化合物5(21 mg)、13(19 mg)；Fr.C4-5(639 g) 经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-正丁醇(70∶30)洗脱，得化合物2(18 mg)、8(25 mg)。Fr.C5(1 415 mg) 经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-正丁醇(85∶15～65∶45～15∶85)梯度洗脱，得到6个组分Fr.C5-1～Fr.C5-6，Fr.C5-2(628 g) 经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-正丁醇(85∶15) 进行洗脱，得化合物12(27 mg)。取正丁醇部分浸膏，经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-甲醇(85∶15～50∶50～15∶85)梯度洗脱，得到5个流分Fr.D1～Fr.D5。Fr.D2(736 g) 经硅胶柱分离，以乙酸乙酯-甲醇(75∶25～50∶50～25∶75)梯度洗脱，得到7个组分Fr.D2-1～Fr.D2-7，Fr.D2-4(1 513 g) 经硅胶柱，以丙酮-甲醇(40∶60)洗脱，得化合物4(23 mg)；Fr.D2-6(847 g) 经Sephadex LH-20柱，以甲醇进行洗脱，得化合物9(22 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色油状(甲醇)，ESI-MSm/z：177.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.61(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.27(1H，m，H-5)，5.82(1H，s，H-2)，5.33(1H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-8)，4.61(1H，m，H-6)，3.02(1H，m，H-7b)，1.65(1H，m，H-7a)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：173.8(C-1)，111.6(C-2)，163.7(C-3)，122.6(C-4)，139.1(C-5)，66.2(C-6)，38.1(C-7)，78.3(C-8)。以上数据与文献[4]基本一致，故鉴定为aquilegiolide。

化合物2：白色粉末(丙酮)，ESI-MSm/z：300.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.79(2H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-2，5)，7.51(2H，q，J=12.0，8.2 Hz，H-3，4)，4.03(4H，d，J=12.0 Hz，H-1′，1″)，2.03(2H，m，H-2′，2″)，0.94(12H，d，J=12.0 Hz，H-3′，3″，4′，4″)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：132.4(C-1)，130.1(C-2)，130.6(C-3)，130.9(C-4)，141.7(C-5)，139.2(C-6)，71.8(C-1′)，29.1(C-2′)，21.4(C-3′)，22.3(C-4′)，73.5(C-1″)，29.1(C-2″)，19.4(C-3″)，23.1(C-4″)，159.2(C=O)。以上数据与文献[5]基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二异丁酯。

化合物3：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：412.8[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.82(2H，dd，J=8.4，4.2 Hz，H-2，5)，7.71(2H，dd，J=8.4，4.2 Hz，H-3，4)，4.23(4H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-2′，2″)，1.68(2H，m，H-3′，3″)，1.42～1.31(16H，m，H-4′，4″，5′，5″，6′，6″，8′，8″)，0.97～0.85(12H，m，H-7′，7′，9′，9′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：131.9(C-1)，131.9(C-2)，130.2(C-3)，130.2(C-4)，131.9(C-5)，131.9(C-6)，171.3(C-1′)，70.3(C-2′)，39.7(C-3′)， 23.6(C-4′)，24.8(C-5′)，29.5(C-6′)，12.3(C-7′)，32.4(C-8′)，15.1(C-9′)，171.3(C-1″)，70.3(C-2″)，39.7(C-3″)，23.6(C-4″)，24.8(C-5″)，29.5(C-6″)，12.3(C-7″)，32.4(C-8″)，15.1(C-9″)。以上数据与文献[6]基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯。

化合物4：黄色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：219.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：11.82(1H，s，6-OH)，6.21(1H，s，H-5)，5.34(1H，s，2-OH)，4.06(3H，s，H-8)，2.52(2H，s，H-10)，2.08(3H，s，H-9)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：109.1(C-1)，160.3(C-2)，106.1(C-3)，138.2(C-4)，109.2(C-5)，162.1(C-6)，173.1(C-7)，52.4(C-8)，71.2(C-9)，25.6(C-10)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为2，6-dihydroxy-3，4-dimethylbenzoic acid methyl ester。

化合物5：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：468.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.58(4H，brs，H-2，2′，6，6′)，4.81(2H，d，J=8.4 Hz，H-7，7′)，4.31(2H，dd，J=4.2，2.2 Hz，H-9a，9′a)，4.03(2H，d，J=8.4 Hz， H-9b，9′ b)，3.92(12H，s，3，3′，5，5′-OCH3)，3.80(6H，s，4，4′ -OCH3)，3.09(2H，s，H-8，8′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：139.1(C-1)，103.6(C-2)，155.3(C-3)，139.1(C-4)，155.3(C-5)，103.6(C-6)，86.4(C-7)，56.1(C-8)，72.9(C-9)，139.1(C-1′)，103.6(C-2′)，155.3(C-3′)，139.1(C-4′)，155.3(C-5′)， 103.6(C-6′)，86.4(C-7′)，56.1(C-8′)，72.9(C-9′)，56.4(3-OCH3)，62.3(4-OCH3)，56.4(5-OCH3)，56.4(3′-OCH3)，62.3(4′-OCH3)，56.4(5′-OCH3)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为yangambin。

化合物6：白色油状物(甲醇)，ESI-MSm/z：177.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.61(1H，d，J=4.2 Hz，H-4)，6.27(1H，m，H-5)，5.83(1H，s，H-2)，5.35(1H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-8)，4.62(1H，m，H-6)，3.09(1H，m，H-7b)，1.68(1H，m，H-7a)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：176.3(C-1)，113.5(C-2)，163.6(C-3)，122.3(C-4)，139.2(C-5)，65.2(C-6)，38.1(C-7)，78.1(C-8)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为aquilegiolide。

化合物7：白色胶体(甲醇)，ESI-MSm/z：111.4[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.37(1H，brs，-NH)，3.62(2H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz， H-6a)，3.51(1H，ddd，J=8.7，6.3，2.7 Hz，H-7)，2.73(1H，m，H-2)，2.58(2H，ddd，J=8.4，4.2，2.2 Hz，H-6b)，1.97(2H，d，J=7.5 Hz，H-3)，1.64(1H，m，H-8)，1.02(3H，d，J=8.4 Hz，H-10)，0.93(3H，d，J=8.4 Hz，H-9)，0.79(3H， d，J=8.4 Hz，H-1)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：23.1(C-1)，26.3(C-2)，46.5(C-3)，172.8(C- 4)，131.4(C-5)，42.8(C-6)，76.3(C-7)，29.7(C-8)，20.6(C-9)，18.9(C-10)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为xylariamide。

化合物8：黄色粉末(丙酮)，ESI-MSm/z：453.4[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.62(1H，s，H-3)，6.19(1H，s，H-6)，4.92(1H，d，J=8.4 Hz，H-1″)，3.79(2H，m，H-6″)，3.56(1H，m，H-2″)，3.41(1H，s，H-4″)，3.17(2H，s，H-3″，5″)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：127.4(C-1)，163.5(C-2)，103.2(C-3)，183.6(C-4)，159.3(C-5)，97.6(C-6)，163.1(C-7)，105.4(C-8)，155.1(C-9)，103.7(C-10)，122.4(C-1′)，128.1(C-2′)，116.3(C-3′)，160.6(C-4′)， 116.3(C-5′)，128.1(C-6′)，72.8(C-1″)，71.3(C-2″)，79.1(C-3″)，68.2(C-4″)，82.4(C-5″)，60.8(C-6″)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为牡荆素。

化合物9：黄色油状(甲醇)，ESI-MSm/z：217.6[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.13(2H，d，J=4.2 Hz，H-2，6)，6.82(2H，d，J=4.2 Hz，H-3，5)，4.91(1H，s，4-OH)，4.05(2H，q，J=8.4 Hz，9-OCH2CH3)，2.64(2H，t，J=8.4 Hz，H-7)，2.43(2H，t，J=8.4 Hz，H-8)，1.16(3H，t，J=8.4 Hz，9-OCH2CH3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：131.5(C-1)，130.1(C-2)，116.2(C-3)，155.3(C-4)，116.2(C-5)，130.1(C-6)，33.4(C-7)，37.1(C-8)，174.6(C-9)，61.3(9-OCH2CH3)，15.7(9-OCH2CH3)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为3-(4-羟苯基) -丙酸乙酯。

化合物10：黄色油状(甲醇)，ESI-MSm/z：267.3[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.98(2H，d，J=4.2 Hz，H-2′，6′)，6.83(2H，d，J=4.2 Hz，H-3′，5′)，6.27(1H，brs，H-4)，6.15(2H，brs，H-2，6)，3.63(3H，s，5-OH3)，2.79(4H，m，H-α，α′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：44.2(C-1)，107.5(C-2)，160.4(C-3)，98.7(C-4)，160.7(C-5)，108.1(C-6)，134.1(C-1′)，130.4(C-2′)，114.6(C-3′)，153.8(C-4′)，114.6(C-5′)，130.4(C-6′)，37.4(C-α)，37.6(C-α′)，54.9(5-OH3)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为3，4′-二羟基-5-甲氧基联苄。

化合物11：淡黄色粉(甲醇)，ESI-MSm/z：351.4[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.02(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，6.37(1H，d，J=8.4 Hz，H-4′)，6.08(1H，d，J=8.4 Hz，H-3)，5.65(1H，d，J=8.4 Hz，H-3′)，4.38(1H，dd，J=8.4，4.2 Hz，H-2″)，3.79(2H，m，H-3″)，1.52(3H，s，1″-CH3)，1.40(6H，s，2′-CH3)，1.22(3H，s，1″-CH3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：125.7(C-1)，160.1(C-2)，111.3(C-3)，140.7(C-4)，1151.4(C-5)，100.2(C-6)，158.1(C-7)，114.3(C-8)，124.6(C-1′)，77.9(C-2′)，129.1(C-3′)，114.8(C-4′)，43.1(C-1″)，95.1(C-2″)，60.2(C-3″)，02.8(C-4a)，149.7(C-8a)，28.1(2′-CH3)，28.4(2′-CH3)，27.1(1″-CH3)，21.5(1″-CH3)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为oxanordentatin。

化合物12：黄色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：184.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.86(1H，d，J=8.4 Hz，H-4)，7.53(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.82(1H，dd，J=4.2，2.2 Hz，H-6)，6.54(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.07(1H，d，J=8.4 Hz，H-3)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：125.3(C-1)，162.5(C-2)，114.6(C-3)，143.7(C-4)，130.4(C-5)，110.2(C-6)，159.4(C-7)，103.5(C-8)，110.5(C-4a)，157.1(C-8a)。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定为7-羟基香豆素。

化合物13：白色结晶(丙酮)，ESI-MSm/z：284.7[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.13(1H，s，H-12)，3.82(1H，s，H-5)，3.58(1H，d，J=8.4 Hz，H-9b)，3.02(1H，brd，J=8.4 Hz，H-1)，2.79(1H，d，J=8.4 Hz，H-9a)，2.37(1H，brd，J=8.4 Hz，H-3a)，2.19(1H，brd，J=8.4 Hz，H-2a)，2.07(3H，s，H-13)，1.62(1H，m，H-2b)，1.51(1H，m，H-3b)，1.28(3H，s，H-14)，1.06(3H，s，H-15)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：69.4(C-1)，26.1(C-2)，37.4(C-3)，65.2(C-4)，65.2(C-5)，191.8(C-6)，125.1(C-7)，160.4(C-8)，40.1(C-9)，60.3(C-10)，125.1(C-11)，138.4(C-12)，13.2(C-13)，19.1(C-14)，22.4(C-15)。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定为zederone epoxide。

化合物14：棕色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：367.2[M + Na]+。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：14.27(1H，s，6-OH)，6.37(1H，brs，H-3)，6.08(1H，d，J=4.2 Hz，H-5)，5.02(1H，d，J=4.2 Hz，H-1′)，3.91(3H，s，2-OCH3)，3.80(1H，m，H-6′a)，3.68(1H，m，H-6′b)，3.53～3.46(3H，m，H-2′，3′，5′)，3.24(1H，m，H-4′)；13C-NMR(125 MHz，CDCl3)δ：105.2(C-1)，166.1(C-2)，91.6(C-3)，164.1(C-4)，97.1(C-5)，163.4(C-6)，204.5(C-7)，33.1(C-8)，100.2(C-1′)，72.9(C-2′)，76.8(C-3′)，70.2(C-4′)，77.1(C-5′)，59.4(C-6′)，55.8(2-OCH3)。以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定为annphenone。

4 抑制细胞增殖活性筛选

采用MTT法[18]检测14个化合物的体外抗OVCaR-3细胞活性，采用5-氟尿嘧啶为阳性对照药物。取对数生长期的OVCaR-3细胞，稀释为单细胞混悬液(密度为5×104/mL)，每孔取100 μL单细胞混悬液置于96孔板中，在37 ℃恒温器中培养12 h。再分别加入5-氟尿嘧啶及化合物1～14(每个化合物均设置0.1、1.0、5.0、10.0、15.0 μg/mL质量浓度梯度)，培养24 h，每孔加入10 μL MTT溶液进行染色，培养12 h，移除上层清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，轻轻摇晃均匀。采用全自动多功能酶标仪在520 nm波长处测定吸光度，计算OVCaR-3细胞的抑制率和IC50值。结果，化合物7、11对OVCaR-3细胞增殖具有体外抑制作用，IC50值分别为9.14、9.03 μg/mL，其中质量浓度为0.1 μg/mL的化合物11与5-氟尿嘧啶对OVCaR-3细胞增殖的抑制活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。