刺梨总三萜的免疫活性研究

田 强,李良群,彭 梅,李艳梅,牛振鹏,李齐激，汪 涛,杨小生

(1 贵州中医药大学 研究生院，贵州 贵阳 550025；2 贵州医科大学 药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014)

药食两用植物资源由于存在天然的抗氧化和抗衰老等成分，在作为药物治疗疾病的同时兼有食品保健功能，因此引发越来越多科研人员的关注[1]。刺梨(RosaroxburghiiTratt.)为蔷薇科蔷薇属植物缫丝花的果实，别名野刺梨、野石榴、茨梨、文光果、油刺果等[2]。据文献记载，刺梨味甘、酸涩、性平，归脾、胃经，具有健胃、消食、止泻的作用，主治食积饱胀，肠炎腹泻，并具滋补强壮之功效[3]。刺梨主要分布于贵州、云南、四川、湖南、湖北、陕西等地，其中贵州野生刺梨资源最为丰富，多分布在海拔1 000～1 600 m的山区丘陵地带[4]。现代研究表明，刺梨富含维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)、黄酮、五环三萜、氨基酸、多糖等化学成分[5-7]，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗癌等多种生物活性[8-13]。刺梨为药食两用植物资源，富含多种营养成分和功效物质，具有很高的营养价值和药用价值，广泛应用于食品、医药、保健品等行业[14-15]。

免疫功能障碍与诸多疾病的发生和发展息息相关[16-18]。最新研究表明，肆虐全球的新冠肺炎病毒(COVID-19)与宿主的免疫系统也具相互联系，可以提高机体的免疫功能并有助于患者的康复[19]。刺梨总提物或刺梨汁由于具有抗氧化、改善机体免疫功能而表现出良好的免疫增强活性[20-24]，但目前对于刺梨中发挥免疫调节作用的物质基础尚不清楚，其中三萜类成分是否有免疫增强作用也有待进一步研究。基于此，本试验研究了刺梨总三萜对免疫抑制小鼠的影响，结合RAW264.7巨噬细胞试验，从体内外综合评价刺梨总三萜的免疫活性，初步探索其发挥免疫调节作用的可能机制，旨在为刺梨相关药物和免疫保健功能产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

刺梨鲜果采于贵州贵定敏子食品有限公司刺梨种植基地，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为蔷薇科植物缫丝花(RosaroxburghiiTratt) 的果实。

SPF级昆明小鼠60只，雌雄各半，体质量18～22 g/只，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：XSCXK(辽)2020-0001；小鼠腹腔RAW264.7巨噬细胞，购于中国科学院干细胞库。

注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide for injection,CTX)，百特国际有限公司；香菇多糖片(Lentinan,LNT)，武汉迪奥药业有限公司；白介素IL-2、IL-4、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒，博士德生物工程有限公司；酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和过氧化氢酶(CAT)试剂盒，南京建成生物工程研究所；白细胞稀释液，北京索莱宝科技有限公司；PBS缓冲液(pH 7.4)，BIOEXPLORER；胰蛋白酶、DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、双抗(10 kU/mL青霉素+10 mg/mL链霉素组成的100×工作液)，Gibco；二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，美国Sigma公司；注射用氯化钠，贵州科伦药业有限公司；NO检测试剂盒(Nitric Oxide Assay Kit)，上海碧云天生物技术有限公司。

多功能酶标仪,PerkinElmer公司；冷冻离心机，Centrifuge 5427 R；电子天平，上海菁海仪器有限公司；倒置光学显微镜，Nikon；-80 ℃超低温冰箱、CO2培养箱，Thermo。

1.2 刺梨总三萜的制备

参考文献[25]的方法制备刺梨总三萜(TR)。

1.3 刺梨总三萜对免疫抑制小鼠的影响

1.3.1 试验设计 将SPF级昆明小鼠(雌雄各半)于(25±2) ℃、光照12 h/d、相对湿度40%～45%的环境中饲养，自由进食、饮水。小鼠适应环境1周后，取50只，按70 mg/(kg· d)的剂量腹腔注射CTX，连续注射7 d，构建免疫抑制小鼠模型。将50只建模小鼠按雌雄各半随机平均分为模型组(M)、阳性对照组(P)以及总三萜高剂量组(TH)、中剂量组(TM)和低剂量组(TL)，另取10只正常SPF小鼠作为空白对照组(B)。空白对照组和模型组小鼠按每10 g体质量0.1 mL的剂量灌胃生理盐水；阳性对照组小鼠以3 mg/kg剂量灌胃香菇多糖片；总三萜高、中、低剂量组分别按200，100和50 mg/kg剂量灌胃刺梨总三萜。各组小鼠每天灌胃1次，连续14 d。末次给药后禁食12 h，称体质量，眼眶静脉丛采血，部分血样用于全血白细胞计数；其余血液冰浴静置30 min，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取血清，-20 ℃储存备用。取脾脏和胸腺，称质量,备测。剪取小鼠的部分脾脏，用PBS冲洗干净，用于制备组织切片，HE染色后观察；其余脾脏样品冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 全血白细胞数测定 取0.5 mL离心管，加白细胞稀释液380 μL，再加20 μL小鼠全血，立即混匀，待红细胞完全破坏，液体变成棕褐色后，再次混匀，取10 μL冲池至细胞计数板上，室温静置2～3 min，待白细胞沉淀后，置于显微镜低倍镜下依次计数四角4个大方格内的白细胞(N)，计算白细胞数：白细胞数=(N÷20)×109。

1.3.3 小鼠免疫器官指数测定 计算小鼠胸腺指数和脾脏指数：胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g)；脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)。

1.3.4 血清细胞因子水平和酶活力测定 取冻存的血清，用ELISA试剂盒分别测定IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α含量；按照试剂盒使用说明，测定ACP和LDH活力。

1.3.5 抗氧化能力测定 取脾脏组织样品约50 mg，用眼科剪尽快剪碎成组织块，加入约9倍体积的生理盐水，在匀浆管中匀浆，制备体积分数10%的匀浆液。将脾脏匀浆液2 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明分别测定丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活力。

1.3.6 脾损伤观察 将小鼠脾脏组织冲洗干净，放入体积分数4%的多聚糖甲醛溶液中固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红染色中性树胶封片，显微镜观察、拍照。

1.4 刺梨总三萜对小鼠巨噬细胞RAW264.7的影响

1.4.1 对RAW264.7细胞增殖的影响 将小鼠巨噬细胞RAW264.7接种于高糖DMEM完全培养基中(含有体积分数10% FBS和1%双抗)，置37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。选择对数生长期的RAW264.7细胞，调整其密度为4×104mL-1，加入96孔细胞培养板中，每孔90 μL，过夜培养后，设置1.25，2.5，5，10，20 μg/mL(终质量浓度)刺梨总三萜组及空白对照组，每组5孔重复。刺梨总三萜组每孔加相应质量浓度药物10 μL，空白对照组加等体积的无血清培养基，继续培养24 h；弃去上清液，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，于37 ℃继续孵育4 h；弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振荡混匀后于490 nm处测定吸光值(OD490)。设置3次独立试验获得最终结果，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(试验组OD490/空白对照组OD490)×100%。

1.4.2 对RAW264.7细胞NO分泌量的影响 将RAW264.7细胞接种于24孔板，每孔450 μL，细胞接种量为5×105孔-1，培养过夜后，分为空白对照组、总三萜TR组、模型组及总三萜低、中、高剂量组。模型组和总三萜低、中、高剂量组给予一定体积的LPS(终质量浓度6 μg/mL)诱导，空白对照组和TR组用等量无血清培养基补足。2 h后，总三萜低、中、高剂量组加一定体积的总三萜，使其终质量浓度分别为1.25，2.5，5 μg/mL，TR组给予总三萜，使其终质量浓度为5 μg/mL；空白对照组和模型组用等体积无血清培养基补足。给药后于37 ℃继续培养24 h，每孔吸取50 μL培养上清液于96孔板中，重复3孔，按照NO检测试剂盒说明书操作，每孔分别添加GriessⅠ和GriessⅡ试剂各50 μL，振荡混匀后，于540 nm波长处检测其OD值(OD540)。设置3次独立试验获得最终结果。依照事先绘制的NaNO2标准曲线(按照NO检测试剂盒绘制)，计算细胞上清液中的NO浓度。

1.5 数据统计分析

结果以“平均值±标准差”表示。试验数据使用GraphPad Prism 8.0.1软件作图及统计学分析，多组数据之间的差异采用单因素方差分析与Bonferroni校正。

2 结果与分析

2.1 刺梨总三萜对小鼠全血白细胞数的影响

由图1可知，与空白对照组相比，模型组小鼠白细胞数极显著降低(P<0.01)，表明其免疫力减退，免疫抑制小鼠模型构建成功。与模型组相比，阳性对照组和总三萜低、中、高剂量组小鼠血液中的白细胞数量均极显著升高(P<0.01)，且不同剂量总三萜组高于阳性对照组，表明刺梨总三萜可提高免疫抑制小鼠的白细胞数量，且效果优于香菇多糖片。阳性对照组和总三萜低、中、高剂量组的白细胞数量虽低于空白对照组，但差异不明显。

2.2 刺梨总三萜对小鼠免疫器官指数的影响

由图2可见，与空白对照组相比，模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均极显著降低(P<0.01)，说明建模成功。与模型组相比，阳性对照组和总三萜低剂量组胸腺指数显著升高(P<0.05)，总三萜中剂量组和高剂量组胸腺指数极显著升高(P<0.01)；与模型组相比，总三萜低剂量组脾脏指数显著升高(P<0.05)，阳性对照组和总三萜中、高剂量组脾脏指数均极显著升高(P<0.01)。与空白对照组相比，阳性对照组和总三萜低、中剂量组胸腺指数有所降低；阳性对照组和总三萜中、高剂量组脾脏指数略有升高，总三萜低剂量组脾脏指数略有降低；但均无显著性差异。

2.3 刺梨总三萜对小鼠血清中免疫因子水平和酶活力的影响

由表1可以看出，与空白对照组相比，模型组小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平均极显著降低(P<0.01)，这说明环磷酰胺可以抑制小鼠的免疫功能。与模型组相比，不同剂量总三萜组小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平升高(除低剂量组IL-4水平外)，尤其是IL-2和IL-6水平升高明显，均达显著水平，这说明刺梨总三萜可以通过调节细胞因子的水平改善由环磷酰胺诱导的免疫抑制。

表1 刺梨总三萜对小鼠血清中细胞因子含量的影响(n=10)Table 1 Effects of total triterpenes from Rosa roxburghii Tratt in serum cytokine content of mice(n=10)

由图3可知，模型组小鼠血清中的ACP和LDH活力均极显著低于空白对照组(P<0.01)。与模型组相比，阳性对照组和总三萜低、中、高剂量组的ACP活力均极显著提高(P<0.01)；阳性对照组和总三萜高剂量组的LDH活力极显著提高(P<0.01)。该结果表明，刺梨总三萜可上调免疫抑制小鼠体内ACP和LDH的活力。

2.4 刺梨总三萜对小鼠脾脏抗氧化能力的影响

刺梨总三萜对小鼠MDA含量和CAT活力的影响见图4。

由图4可知，在本试验设置的6个组中，与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏中的MDA含量极显著升高(P<0.01)，CAT活力极显著降低(P<0.01)，表明建模成功。与模型组相比，阳性对照组和总三萜低、中、高剂量组的MDA含量均极显著降低(P<0.01)，CAT活力均极显著升高(P<0.01)。结果表明，刺梨总三萜可提高免疫抑制小鼠的抗氧化能力。

2.5 刺梨总三萜对小鼠脾损伤的影响

染色观察结果(图5)显示，空白对照组(B组)小鼠的脾脏组织结构正常，细胞排列未见异常。模型组(M组)脾脏组织细胞数量明显减少，排列无序。与模型组相比，阳性对照组(P组)和刺梨总三萜低、中、高剂量组(TL、TM、TH组)细胞较多，排列紧密。结果表明，刺梨总三萜可以缓解由CTX所致的免疫器官损伤。

2.6 刺梨总三萜对RAW264.7细胞增殖的影响

由图6可以看出，与空白对照组(0 μg/mL刺梨总三萜)相比，刺梨总三萜处理组小鼠巨噬细胞的增殖率均升高，当刺梨总三萜的终质量浓度为1.25～5 μg/mL时，巨噬细胞增殖率显著或极显著升高。

2.7 刺梨总三萜对RAW264.7细胞NO分泌量的影响

由图7可知，TR组NO含量与空白对照组无显著性差异，表明刺梨总三萜(5 μg/mL)单独作用RAW264.7细胞时，对巨噬细胞NO的分泌量没有影响。总三萜低、中、高剂量组NO含量较模型组明显降低，其中高剂量组差异达显著水平，表明总三萜可降低LPS诱导的巨噬细胞的NO分泌。结果提示，刺梨总三萜具有潜在的抗炎活性。

3 讨论与结论

免疫器官和免疫细胞因子水平、相关酶的变化是机体产生免疫应答的表现[26]。CTX是一种常用的免疫抑制剂，可降低机体的免疫器官指数及淋巴细胞和吞噬细胞的活性[27-29]。本研究通过给小鼠腹腔注射CTX构建免疫抑制模型，结果显示，与空白对照组相比，模型组小鼠的全血白细胞数量及胸腺指数和脾脏指数均极显著降低，说明免疫抑制小鼠模型建模成功。

胸腺、脾脏作为重要的免疫器官，与机体的免疫功能紧密相关。血液白细胞数量和免疫器官变化是机体免疫功能变化最直观的反映，当免疫功能受到抑制时，常伴随着白细胞数量和免疫器官指数的降低[28-30]。本研究发现，与模型组比较，总三萜试验组小鼠白细胞数量和胸腺脾脏指数显著或极显著升高，脾脏组织中的细胞数量和排列情况得到了极大改善，说明刺梨总三萜能缓解CTX对胸腺、脾脏的损伤，提升免疫细胞的数量，增强机体免疫功能。

巨噬细胞是机体内非常重要的一类免疫细胞，其作用是吞噬、杀灭外来病原体并释放细胞因子而参与免疫应答，而ACP和LDH的活性能够直观地反映巨噬细胞的激活程度[31-33]。本研究结果显示，与模型组比较，刺梨总三萜各剂量组小鼠的ACP活力极显著增强，高剂量组的LDH活力极显著升高(P<0.01)，这说明刺梨总三萜可以调节小鼠体内的ACP和LDH活力。另外，体外细胞试验结果显示，1.25～5 μg/mL刺梨总三萜可显著或极显著促进RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖。在用LPS诱导巨噬细胞构建炎症模型基础上，检测巨噬细胞的NO分泌量可用于评价药物潜在的抗炎活性[34]。本研究发现，刺梨总三萜直接作用于巨噬细胞，对细胞的NO分泌量无显著影响，但可显著降低LPS诱导的巨噬细胞的NO分泌量。这表明刺梨总三萜具有潜在的抗炎免疫活性，其具体的作用机制有待进一步探究。

细胞因子具有多种免疫功能，并参与免疫调节。小鼠Th1亚群分泌产生IL-2，Th2亚群分泌产生IL-4，IL-2和IL-4均能促进T细胞的增殖，且IL-4还可以增强B细胞的提呈抗原能力，提升IgG1和IgE水平，使免疫系统对抗原刺激产生免疫反应[35-37]。IL-6和TNF-α是巨噬细胞主要的细胞因子，IL-6存在于多种免疫反应中，可以促进淋巴细胞的增殖、分化；TNF-α作为促炎细胞因子，能直接杀灭肿瘤细胞，参与宿主的炎症反应和免疫反应[38-39]。本研究结果显示，与模型组比较，刺梨总三萜处理小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α的含量整体明显升高，说明其可通过影响小鼠血清中的免疫细胞因子水平而发挥免疫调节作用。

MDA是免疫系统产生的一种脂质过氧化物，对体内自由基代谢异常反应较为灵敏[40]；CAT可以减少毒性氢氧自由基的形成，保护抗氧化系统[41-42]。本研究结果显示，与模型组比较，刺梨总三萜处理组小鼠脾脏组织的MDA含量极显著降低(P<0.01)，而CAT极显著增强(P<0.01)，说明刺梨总三萜可以通过提升小鼠抗氧化应激能力而发挥免疫调节作用。