外源低分子有机酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发的影响

李芹梅，潘曲波，闻永慧，夏小丽，彭麟迪，汪 琼

(西南林业大学 园林园艺学院，国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心，云南 昆明 650224)

重金属污染是全球性问题，也是人们关注的焦点。铜是植物必需的微量营养元素，但过量时会有害，妨碍植物生长和新陈代谢[1]。2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国土壤重金属总的点位超标率为16.1%，其中铜污染位居第4位，点位超标率占2.1%[2]。因此，对铜污染土壤防治措施研究具有重要意义。

外源化学品处理是一种简单易行、见效快的降解植物重金属毒性的方法[3]。苹果酸和柠檬酸作为重要的低分子有机酸，参与植物生理代谢过程，对植物耐旱性、耐寒性、抗养分胁迫和抗重金属胁迫能力等具有调节作用[4-5]。研究表明，添加适量有机酸对植物种子萌发、生长有显著影响，能增加植株生物量。庄正等[6]发现，低浓度苹果酸和柠檬酸能促进杉木种子萌发及幼苗生长。低浓度柠檬酸浸种能提高番茄种子发芽率、发芽势和发芽指数[7]。15%柠檬酸浸种能提高苦荞种子萌发率，促进幼苗生长[8]。植物根系分泌的有机酸能提高其根系活力，促进养分吸收和幼苗根系生长[9-10]。詹淑威等[11]发现加入苹果酸和柠檬酸能显著提高小飞扬草根系活力、减小根细胞膜透性。镉胁迫下加入柠檬酸能使苎麻根系活力上升，缓解重金属毒性[12]。铝胁迫下植株根系会分泌柠檬酸和苹果酸来抵御铝毒害，缓解根际铝毒[13-14]。

珊瑚樱(SolanumpseudocapsicumL.)是茄科茄属常绿小灌木，其果实为球形，观赏期达3个月以上，是深受人们喜爱的观果植物[15-16]。前期研究发现，珊瑚樱果实中含有大量低分子有机酸，主要成分为苹果酸和柠檬酸。有机酸能与重金属离子络合，通过植物吸收、运输、积累等过程，降低重金属毒性[5,17]。在重金属胁迫下，不同浓度有机酸可能会影响珊瑚樱生理代谢(如种子萌发、根系活力等)。因此，可考虑将珊瑚樱作为修复重金属土壤污染的植物材料。目前有关苹果酸和柠檬酸对重金属胁迫下珊瑚樱种子萌发的影响研究报道很少。鉴于此，本研究以珊瑚樱种子为试验材料，研究不同浓度苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发的影响，以充实有机酸缓解重金属毒害作用的理论数据，为后续深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

成熟珊瑚樱果实采自西南林业大学一号门(E102°44′49″，N25°03′50″)旁边。

1.2 试验设计

1.2.1 珊瑚樱果实中有机酸成分提取 采集成熟珊瑚樱果实19.02 g(鲜质量)，捣碎后用200 mL甲醇浸泡48 h并过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至20 mL后用石油醚等体积萃取3次，下层溶液真空浓缩后用色谱纯甲醇溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤后得到待测样品。

1.2.2 铜质量浓度筛选 挑选籽粒饱满均匀的珊瑚樱种子，在室温下浸种6 h。设置7个质量浓度的CuSO4处理，分别为0(CK)，10，20，40，60，80和100 mg/L。在培养皿底部铺2层定性滤纸，每个处理放40粒种子，加入5 mL处理液，每个处理重复5次。将培养皿放置于(25±1) ℃的培养箱中进行常规催芽。种子萌发期间，每天上午10:00观察、记录种子发芽数，更换滤纸并施加处理液。

1.2.3 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子的处理 根据1.2.1和1.2.2试验结果，发现在半致死状态下，CuSO4溶液质量浓度为40 mg/L，将此设置为铜胁迫水平。外源分别施加苹果酸(MA)和柠檬酸(CA)对珊瑚樱种子进行处理，其浓度分别为1，3，5和10 mmol/L。试验共设置9个处理，分别为Cu40(pH 5.81)，Cu40+MA1(pH 3.31)，Cu40+MA3(pH 3.05)，Cu40+MA5(pH 2.83)，Cu40+MA10(pH 2.60)，Cu40+CA1(pH 3.20)，Cu40+CA3(pH 2.72)，Cu40+CA5(pH 2.62)和Cu40+CA10(pH 2.44)，其余处理方式同1.2.2。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 有机酸成分 采用HPLC-LTQ-Orbitrap(美国赛默飞世尔科技公司)XL测定珊瑚樱果实中的有机酸成分，通过Thermo xcalibur qual browser筛选软件建立各化合物的分子式数据库信息表，设立正离子模式下H+和Na+2种加合物离子，化合物筛选的离子提取窗口宽度为3×10-6。

1.3.2 种子萌发指标 以胚根长2 mm作为发芽标准，每24 h统计1次发芽数，记录第1粒种子发芽时间和种子萌发峰值时的时间，第4天计算发芽势，第8天终止珊瑚樱种子萌发试验，从5个重复中随机取样10株用游标卡尺测量珊瑚樱芽长，精确到0.01 cm，参考郝俊峰等[18]的方法计算萌发指标：

发芽率=(第8天发芽种子数/供试种子总数)×100%。

发芽势=(第4天发芽种子数/供试种子总数)×100%。

发芽指数=∑(t天的发芽数/相应的发芽时间)。

活力指数=芽长×发芽指数。

平均发芽速率=∑(第t天的发芽数×相应发芽粒数)/总发芽粒数。

1.3.3 根系活力 采用TTC法[19]对珊瑚樱根系活力进行测定。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 26.0软件，对苹果酸和柠檬酸处理铜胁迫下珊瑚樱种子受抑的缓解作用进行相关性分析、主成分分析和聚类分析，绘图用Origin 2021软件完成。

2 结果与分析

2.1 珊瑚樱果实中的有机酸成分

通过高分辨质谱的精确相对分子量等结构信息，确定珊瑚樱果实含有的有机酸主要为苹果酸和柠檬酸，其Na+加合物离子精确相对分子质量、强度等见表1。

表1 成熟珊瑚樱果实中的有机酸成分Table 1 Determination of organic acids in mature Solanum pseudocapsicum fruits

2.2 铜胁迫对珊瑚樱种子萌发的影响

从表2可以看出，随铜质量浓度增加，珊瑚樱种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和芽长均呈先增后降趋势。在铜质量浓度为20 mg/L时，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和芽长都达到最大值，与CK均有显著性差异(P<0.05)。当铜质量浓度大于40 mg/L时，珊瑚樱种子活力指数和芽长显著受抑(P<0.05)。与CK相比，40，60，80和100 mg/L CuSO4溶液处理珊瑚樱种子活力指数分别降低52.28%，66.04%，75.57%和85.30%，芽长分别缩短51.29%，64.22%，72.84%和82.33%。综上可知，铜质量浓度为40 mg/L时，珊瑚樱种子发芽率显著降低，且活力指数和芽长的降幅均超过50%，因此确定珊瑚樱种子铜胁迫质量浓度为40 mg/L 。

表2 铜胁迫对珊瑚樱种子萌发的影响Table 2 Effects of copper stress on seed germination of Solanum pseudocapsicum

2.3 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发特性的影响

2.3.1 对发芽时间和平均发芽速率的影响 从表3可知，铜胁迫下，用5 mmol/L苹果酸(MA)处理后，第1粒珊瑚樱种子发芽时间比Cu40处理种子提前了1 d，其平均发芽速率最快。当苹果酸浓度为10 mmol/L时，第1粒珊瑚樱种子发芽时间、平均发芽速率均比Cu40处理种子时间长。而用不同浓度柠檬酸(CA)处理的第1粒珊瑚樱种子发芽时间、平均发芽速率均比Cu40处理种子慢。

表3 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子发芽时间及平均发芽速率的影响Table 3 Effects of malic acid and citric acid on germination time and average germination rate of Solanum pseudocapsicum seeds under copper stress

2.3.2 对种子萌发的影响 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发的影响见表4。

表4 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发的影响Table 4 Effects of malic acid and citric acid on seed germination of Solanum pseudocapsicum under copper stress

从表4可知，当苹果酸浓度为5 mmol/L时，珊瑚樱种子发芽率、发芽指数和活力指数都达到最大值，与Cu40处理种子相比分别提高24.02%，42.49%和50.49%，且均有显著性差异(P<0.05)。当苹果酸浓度为10 mmol/L时，珊瑚樱种子发芽势、活力指数和芽长均较Cu40处理显著下降(P<0.05)，说明低浓度苹果酸能缓解铜胁迫对珊瑚樱种子萌发的抑制作用，而高浓度苹果酸会抑制珊瑚樱种子发芽后的芽苗生长。铜胁迫下不同浓度柠檬酸仅能提高珊瑚樱种子发芽率，与Cu40处理相比，1，3，5，10 mmol/L柠檬酸处理种子发芽率分别提高5.25%,9.68%,10.78%和11.90%，而对发芽势、发芽指数、活力指数和芽长等指标均无缓解作用。表明苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发有一定缓解作用，且苹果酸的缓解效果显著优于柠檬酸。

2.4 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子根系活力的影响

从图1-A可知，随苹果酸浓度增加，珊瑚樱根系活力呈先增后减趋势，当苹果酸浓度为5 mmol/L时，根系活力最大为1.79 mg/(g·h)，显著高于Cu40处理(P<0.05)，其余均显著低于Cu40处理。从图1-B可知，随柠檬酸浓度增加，珊瑚樱根系活力呈下降趋势，均显著低于Cu40处理(P<0.05)，柠檬酸浓度为10 mmol/L时，珊瑚樱种子发芽后芽苗停止生长，即柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱根系活力的降低没有起到缓解作用。

2.5 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发影响的综合评价

2.5.1 萌发特性的相关性分析 从表5可知，苹果酸浓度与珊瑚樱发芽势呈显著负相关(P<0.05)，与芽长和根系活力呈极显著负相关(P<0.01)。柠檬酸浓度与活力指数、芽长和根系活力均呈极显著负相关(P<0.01)，与其他指标相关性均不显著。

表5 苹果酸和柠檬酸与铜胁迫下珊瑚樱种子萌发特性的相关性分析Table 5 Correlation analysis of malic acid,citric acid and seed germination characteristics of Solanum pseudocapsicum under copper stress

2.5.2 萌发指标的主成分分析 以不同浓度苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发指标进行主成分分析，结果如表6所示。由表6可知，从苹果酸缓解铜胁迫(Cu40)各指标中提取出2个主成分，主成分1贡献率为73.84%，主成分2贡献率为20.16%，累计贡献率达94.00%，其中主成分1载荷最高的是活力指数(0.437 92)，其次是发芽势(0.406 53)；主成分2载荷最高的是发芽率(0.738 14)。从柠檬酸缓解铜胁迫各影响指标中只提取了1个主成分，其贡献率为85.90%，以活力指数(0.400 52)载荷最高。

表6 苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发指标的主成分分析Table 6 Principal component analysis on the influence of malic acid and citric acid on various indexes of seed germination of Solanum pseudocapsicum under copper stress

2.5.3 萌发影响的聚类分析 为进一步筛选苹果酸和柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发缓解作用的最佳浓度，对种子萌发各指标进行聚类分析，结果见图2。从图2-A可知，在欧氏距离为15时，将不同浓度苹果酸处理聚为2类，其中以0，1和10 mmol/L 为第Ⅰ类，3和5 mmol/L为第Ⅱ类，表明苹果酸为3和5 mmol/L时缓解效果较好。从图2-B可知，在欧氏距离为10时，将不同浓度柠檬酸处理聚为两类，其中以0 mmol/L为第Ⅰ类，1～10 mmol/L为第Ⅱ类，表明柠檬酸对铜胁迫(Cu40)下珊瑚樱种子萌发缓解效果不佳。

3 讨 论

种子能否正常萌发和成苗决定着植物种群的繁衍与生存[20]，在萌发过程中其易受外界环境影响，重金属污染是其中最重要的影响因素。但也有植物表现出对重金属的超强耐受性，如蓖麻[21]种子在铜锌复合质量浓度为1 320 mg/L时仍未死亡，表明其对Cu2+和Zn2+复合胁迫具有很强的耐受性。本研究发现，随铜质量浓度增加，珊瑚樱种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及芽长等指标均呈现出低促高抑现象，与在高羊茅[22]和水稻[23]上的研究结果一致。当铜质量浓度为40 mg/L时，珊瑚樱种子发芽率显著受抑，活力指数和芽长的受抑程度均达到50%，故将此视为半致死浓度。

苹果酸和柠檬酸是植物体内重要的营养物质和常见的有机酸，也是植物生理代谢的主要调节物质，对植物生长发育有着显著影响[4-5]。本研究发现，当苹果酸浓度为5 mmol/L时，珊瑚樱种子发芽率、发芽指数和活力指数均达到最大值；苹果酸浓度与发芽势呈显著负相关(P<0.05)，与芽长和根系活力呈极显著负相关(P<0.01)。表明低浓度苹果酸能缓解铜胁迫对珊瑚樱种子萌发的抑制作用，而高浓度苹果酸会抑制珊瑚樱种子发芽后芽苗的生长，这与在甜瓜[24]、荞麦[25]和杉木[6]上的研究结果一致。主成分分析表明，活力指数可作为评价有机酸缓解铜胁迫(Cu40)对珊瑚樱种子萌发影响的重要参数；聚类分析进一步表明，3和5 mmol/L苹果酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发的缓解效果较佳。对不同浓度柠檬酸缓解铜胁迫下珊瑚樱种子萌发各指标进行分析发现，铜胁迫下柠檬酸仅能提高珊瑚樱种子发芽率，而对发芽势、发芽指数、活力指数和芽长等指标的影响较小，此结果与在水稻[26]、黑麦草[27]和番茄[7]上的研究结果不一致。柠檬酸浓度与珊瑚樱种子活力指数、芽长和根系活力呈极显著负相关(P<0.01)，而与其他指标相关均不显著。从聚类分析结果可知，1～10 mmol/L柠檬酸聚为一类，表明柠檬酸对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发受抑的缓解效果不佳。由此可知，不同浓度和pH有机酸对不同植物种子萌发、生长发育的影响有别。

根系活力是反映植物根系生命活动的一项指标[28]。本研究发现，苹果酸浓度与珊瑚樱根系活力呈极显著负相关(P<0.01)，表明适宜浓度(5 mmol/L)苹果酸能促进珊瑚樱根系生长发育、缓解铜毒害，而高浓度苹果酸反而会降低其根系活力，这与在油菜[28]、小白菜[29]和玉米[30]上的研究结果一致。不同浓度柠檬酸对铜胁迫抑制珊瑚樱根系活力无显著缓解效果，这与在荞麦[31]上的研究结果不一致。

4 结 论

本研究根据珊瑚樱果实中低分子量有机酸配制不同浓度苹果酸、柠檬酸，分析其对铜胁迫下珊瑚樱种子萌发的影响。结果发现，随铜质量浓度增加，珊瑚樱种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及芽长等指标表现出低促高抑现象。当铜质量浓度为40 mg/L时，珊瑚樱种子发芽率显著受抑(P<0.05)，且活力指数和芽长受抑程度均达到50%。相关性分析表明，高浓度苹果酸和柠檬酸会抑制珊瑚樱种子发芽后芽苗的生长。通过主成分分析和聚类分析可知，活力指数可作为评价有机酸缓解铜胁迫下珊瑚樱种子萌发受抑的重要参数，苹果酸和柠檬酸对铜胁迫抑制珊瑚樱种子萌发均有一定缓解作用，但苹果酸的缓解效果显著优于柠檬酸，苹果酸浓度为5 mmol/L时，对铜胁迫抑制珊瑚樱种子萌发的缓解效果最佳。