复合酶提取黑木耳黑色素的工艺优化及其抗氧化活性分析

袁 源，阎熠晗，吴福泉，张凤培，黄海辰，吴小平，傅俊生

(福建农林大学 a生命科学学院，b菌物研究中心，福建 福州 350002)

黑木耳(Auriculariaheimuer)又名光木耳，隶属于担子菌门、伞菌纲、木耳目、木耳科、木耳属[1]。迄今为止，黑木耳在我国的人工栽培历史已有1 400多年，广泛分布于东北、西南和东南等地区，现已成为我国第二大食用菌栽培品种，其产量仅次于香菇[2-3]。其富含多糖、蛋白质、黄酮和黑色素等活性成分，有益于人体健康，具有较大的开发和应用潜能[4]。其中，黑色素是一种呈深褐色至黑色的天然生物色素，通常是由吲哚、酚和羟基萘酚等环状亚单位形成的聚合物，普遍存在于动物、植物和原生生物中[5]。研究表明，天然黑色素具有良好的抗氧化、抗辐射、免疫调节和保肝活性[6-9]等功能。因此，高效提取黑木耳黑色素具有重要的实用意义。

酶法提取工艺是一种有效的提取方法，能迅速破坏细胞壁，促进细胞内活性物质的溶出，以提高活性物质的提取效率，具有反应条件温和、特异性和高效性等特点[10]。复合酶协同提取工艺则是通过结合2种及以上的酶破坏细胞的多个结构，从而实现活性物质的高效提取[11-12]。黑木耳中含有丰富的纤维素和果胶，用复合酶提取能有效促使细胞壁破裂，加速活性成分大量浸出，研究人员使用超声波辅助纤维素酶和木瓜蛋白酶显著提高了黑木耳多糖的提取得率[13-14]。但目前尚未见有关复合酶协同提取黑色素的相关报道，故本研究探究了复合酶提取黑木耳黑色素的条件，并对优化条件下提取的黑色素进行表征和抗氧化活性分析，以期为黑木耳黑色素产品的开发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材 料 黑木耳新品种‘农黑2号’(编号2020004)由福建省种子总站鉴定。

1.1.2 试剂和仪器 氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁和过氧化氢等均为国产分析纯。纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)、维生素C，均购于Solarbio公司。

所用仪器：YF8-1多功能粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)、JA2003B电子天平(上海基平科学仪器有限公司)、HH-2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、ST16R型离心机(美国Thermo公司)和FE-20型pH计(梅特勒托利多仪器有限公司)。

1.2 黑色素的提取

参考侯若琳等[6]的方法，并稍加修改。将黑木耳子实体干品打磨成粉末，过孔径0.15 mm标准筛，准确称取1 g黑木耳子实体粉末，在特定温度、复合酶质量比、酶添加量、酶解pH、液(mL)料(g)比和酶解温度的酶解液中反应一段时间，然后10 000 r/min下离心3 min取沉淀。其中，纤维素酶溶于pH为4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，果胶酶和木瓜蛋白酶溶于水。按照1∶40的液料比将沉淀充分溶于1 mol/L NaOH溶液，反应1 h后10 000 r/min下离心3 min取上清。使用6 mol/L HCl调上清pH为1.5～2.0，置于80 ℃条件下水浴10 h，水浴结束后10 000 r/min下离心3 min获得沉淀即为黑色素粗品。将沉淀依次用去离子水、氯仿、乙酸乙酯、体积分数95%乙醇和去离子水反复洗涤3次，6 000 r/min离心3 min获得沉淀。最后，用0.1 mol/L NaOH将沉淀复溶，再用0.1 mol/L HCl将提取液pH调至中性，流水透析48 h后，真空冷冻干燥即得黑木耳黑色素纯品。黑木耳黑色素提取得率的计算公式为：

提取得率=黑色素粗品质量/子实体粉末质量×100%。

1.3 红外全吸收光谱的测定

参照李琦等[15]的方法，将纯化的黑木耳黑色素和溴化钾粉末按照1∶200的质量比研磨为细粉进行压片，在500～4 000 cm-1内测定其红外吸收光谱。

1.4 单一酶单因素试验

准确称取1 g黑木耳子实体粉末，在酶解pH 4.5，液料比10∶1，酶解温度40 ℃，酶解时间60 min的条件下，分别进行纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶用量(均设0,5,10,15,20,25 mg/g)3个因素的单因素试验，以黑木耳黑色素提取得率为指标，探究各种酶对黑色素提取得率的影响，确定酶的最佳用量。每组试验重复3次，结果取平均值。

1.5 复合酶单因素试验

基于单一酶最佳用量，准确称取1 g黑木耳子实体粉末，以黑木耳黑色素提取得率为指标，依次探究纤维素酶/果胶酶/木瓜蛋白酶质量比、复合酶添加量、酶解pH、液料比、酶解温度和酶解时间6个因素，对黑色素提取得率的影响，确定各因素的最佳水平。每组试验重复3次，结果取平均值。

1.5.1 复合酶质量比 在酶解pH 4.5、液料比10∶1、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min、酶添加量15 mg/g的条件下，探究纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶三者质量比(0∶0∶0，1∶0∶1，0∶1∶1，1∶1∶0，1∶1∶1，2∶1∶0，2∶0∶1，1∶2∶0，1∶0∶2，0∶1∶2，0∶2∶1，1∶3∶0，1∶0∶3，3∶0∶1，3∶1∶0，0∶3∶1，0∶1∶3，1∶1∶2，1∶2∶1，2∶1∶1)对黑木耳黑色素提取得率的影响。

1.5.2 复合酶添加量 在酶解pH 4.5、液料比10∶1、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min、酶质量比1∶3∶0的条件下，探究复合酶添加量(0，5，10，15，20，25，30 mg/g)对黑木耳黑色素提取得率的影响。

1.5.3 酶解pH 在液料比10∶1、酶解温度40 ℃、酶解时间60 min、酶质量比1∶3∶0、复合酶添加量25 mg/g的条件下，探究酶解pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)对黑木耳黑色素提取得率的影响。

1.5.4 液料比 在酶解温度40 ℃、酶解时间60 min、酶质量比1∶3∶0、复合酶添加量25 mg/g、酶解pH为5.5的条件下，探究液料比(10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1)对黑木耳黑色素提取得率的影响。

1.5.5 酶解温度 在酶解时间60 min、酶质量比1∶3∶0、复合酶添加量25 mg/g、酶解pH 5.5、液料比20∶1的条件下，探究酶解温度(30，35，40，45，50，55 ℃)对黑木耳黑色素提取得率的影响。

1.5.6 酶解时间 在酶质量比1∶3∶0、复合酶添加量25 mg/g、酶解pH为5.5、酶解液料比20∶1、酶解温度35 ℃的条件下，探究酶解时间(20，40，60，80，100，120 min)对黑木耳黑色素提取得率的影响。

1.6 酶解响应面优化试验

根据Box-Behnken中心组合原理，采用Design-expert11软件对复合酶单因素试验结果进行响应面试验。以黑木耳黑色素提取得率为响应值，对酶添加量、酶解pH和酶解温度3个变量进行响应面优化，以获得复合酶提取黑木耳黑色素的最优条件。响应面试验设计见表1。

表1 黑木耳黑色素提取的Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test of melanin extraction from Auricularia heimuer

1.7 黑木耳黑色素的抗氧化活性测定

1.7.1 对DPPH自由基的清除能力 参照侯若琳等[6]的方法并稍作修改，以VC作为阳性对照。吸取100 μL 2×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液和100 μL黑木耳黑色素溶液(0.05，0.25，0.5，1，2，5 mg/mL)于96孔板，混匀后避光室温保存30 min，于517 nm下测定吸光度AX。同时，将黑色素溶液和DPPH无水乙醇溶液分别替换为等体积的蒸馏水，测吸光度A0和AX0，每组试验重复3次，计算自由基清除率。

1.7.2 对ABTS自由基的清除能力 参照Miller等[16]的方法并稍作修改，以VC作为阳性对照。吸取100 μL ABTS+工作液和100 μL黑木耳黑色素溶液(0.05，0.25，0.5，1，2，5 mg/mL)于96孔板，混匀后避光室温保存20 min，于734 nm下测定吸光度AX。将黑色素溶液和ABTS+工作液分别替换为等体积的蒸馏水，测吸光度A0和AX0，每组试验重复3次，计算自由基清除率。

1.7.3 对OH自由基的清除能力 参照白生文等[17]的方法并稍作修改，以VC作为阳性对照。吸取15 μL黑木耳黑色素溶液(0.05，0.25，0.5，1，2，5 mg/mL)、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、9 mmol/L的FeSO4溶液和8.8 mmol/L的H2O2溶液于96孔板，再滴加165 μL蒸馏水使其充分混匀，于37 ℃保存15 min，在510 nm下测定吸光度AX，将黑色素溶液和H2O2分别替换为等体积的蒸馏水，测吸光度A0和AX0，每组试验重复3次，计算自由基清除率。

1.8 数据统计分析

自由基清除率=[1-(AX-AX0)/A0]×100%。

数据用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 25.0软件对试验数据进行显著性分析，组间比较采用t检验，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。采用SPSS 25.0软件计算半数清除浓度(EC50值)。

2 结果与分析

2.1 单一酶对黑木耳黑色素提取得率的影响

2.1.1 纤维素酶的影响 纤维素酶添加量对黑木耳黑色素提取得率的影响如图1-A所示，在一定用量范围内，黑木耳黑色素的提取得率随纤维素酶用量的增加而升高，添加15 mg/g纤维素酶时黑木耳黑色素提取得率最高，之后下降，表明添加15 mg/g纤维素酶提取黑木耳黑色素比较合适。

2.1.2 果胶酶的影响 果胶酶添加量对黑木耳黑色素提取得率的影响如图1-B所示，在一定用量范围内，黑木耳黑色素的提取得率随果胶酶用量的增加而升高，当果胶酶添加量为15 mg/g时，黑木耳黑色素提取得率极显著提高，继续加大果胶酶用量，黑木耳黑色素提取得率趋于稳定，表明添加15 mg/g果胶酶提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.1.3 木瓜蛋白酶的影响 木瓜蛋白酶添加量对黑木耳黑色素提取得率的影响如图1-C所示，在一定用量范围内，黑木耳黑色素的提取得率与木瓜蛋白酶用量呈正相关，当木瓜蛋白酶添加量为10 mg/g时，黑木耳黑色素提取得率极显著提高，继续加大木瓜蛋白酶用量时，黑木耳黑色素提取得率无明显变化，表明添加10 mg/g果胶酶提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.2 复合酶单因素对黑木耳黑色素提取得率的影响

2.2.1 复合酶质量比的影响 复合酶质量比对黑色素提取得率的影响如图2-A所示，与对照组(0∶0∶0)相比，当纤维素酶/果胶酶/木瓜蛋白酶的质量比为1∶3∶0时，黑木耳黑色素提取得率最高，表明采用纤维素酶/果胶酶/木瓜蛋白酶质量比为1∶3∶0,即用纤维素酶和果胶酶配合提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.2.2 复合酶添加量的影响 复合酶添加量对黑木耳黑色素提取得率的影响如图2-B所示，在一定用量范围内，黑色素的提取得率与复合酶添加量呈正相关，添加15，20，25，30 mg/g复合酶均极显著提高了黑色素的提取得率。当复合酶添加量为25 mg/g时，黑色素提取得率最高，之后下降，表明添加25 mg/g复合酶提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.2.3 酶解pH的影响 酶解pH对黑木耳黑色素提取得率的影响如图2-C所示，在一定酶解pH范围内，黑色素提取得率随pH的提高呈先增后减的趋势，当pH为5.5时，黑色素的提取得率最高，表明pH为5.5提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.2.4 液料比的影响 液料比对黑木耳黑色素提取得率的影响如图2-D所示，在一定液料比范围内，黑色素提取得率与液料比呈正相关，当液料比为20∶1时，黑色素提取得率最高，之后下降，表明液料比20∶1提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.2.5 酶解温度的影响 酶解温度对黑木耳黑色素提取得率的影响如图2-E所示，黑木耳黑色素提取得率随着酶解温度的升高呈现出先增加后减少的趋势，当酶解温度为35 ℃时，黑色素的提取得率最高，酶解温度继续升高时提取得率开始下降，可能是因为高温会抑制酶活性。表明酶解温度为35 ℃提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.2.6 酶解时间的影响 酶解时间对黑木耳黑色素提取得率的影响如图2-F所示，酶解60 min时黑木耳黑色素提取得率最高，极显著高于其他处理，随后逐渐下降，可能是因为60 min时酶与底物已基本完成反应。表明酶解时间设为60 min提取黑木耳黑色素比较适宜。

2.3 黑木耳黑色素复合酶提取条件的响应面优化

2.3.1 响应面试验结果 基于单因素试验结果，依据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取酶添加量(A)、酶解pH(B)和酶解温度(C)为自变量，以黑木耳黑色素提取得率(Y)为响应值，设计3因素3水平的响应面试验，结果见表2。

2.3.2 回归方程的建立 使用Desig-expert11软件对黑木耳黑色素得率(表2)进行响应面分析，得到A、B和C3个因素实际值与Y之间的回归方程为Y=13.66+0.31A+0.31B+0.25C+0.05AB-0.18AC-0.18BC-0.88A2-0.68B2-0.61C2。

表2 黑木耳黑色素复合酶提取条件的响应面优化结果Table 2 Results of response surface optimization of extraction conditions of melanin complex enzyme from Auricularia heimuer

通过对该回归方程进行方差分析(表3)发现该模型P<0.01，说明具有极显著性。由该回归方程R2=0.947 1，可知模型拟合度较好，可以准确反映各单因素与响应值之间的关系。模型的一次项A、B、C影响显著(P<0.05)，二次项A2、B2、C2影响极显著(P<0.01)。同时，回归方程的失拟项不显著，表明回归方程与实际值比较吻合，误差较小，可用此回归方程分析和预测黑木耳黑色素的最佳提取条件。

表3 黑木耳黑色素复合酶提取条件优化结果的回归模型方差分析和显著性检验Table 3 Regression model of variance analysis and significance tests for extracting optimization results of melanin complex enzyme from Auricularia heimuer

2.3.3 双因素交互作用 3个因素之间的交互作用对黑木耳黑色素提取得率的影响响应面分析结果(图3)显示，3个曲面陡峭，表明酶添加量与酶解pH、酶解pH与酶解温度及酶添加量与酶解温度之间的交互作用虽不具显著性，但有一定差异。

(1)酶添加量与酶解pH的交互作用。图3-A，B为酶解温度35 ℃时，酶添加量与酶解pH对黑木耳黑色素提取得率影响的响应面和等高线图。由图3-A可知，酶添加量在20～30 mg/g，酶解pH在5.0～6.0时，黑色素提取得率呈先增后减的趋势。酶添加量曲面较酶解pH曲面平缓，说明酶添加量对黑色素提取得率的影响较大。

(2)酶解pH与酶解温度的交互作用。图3-C,D为酶添加量25 mg/g时，酶解pH与酶解温度对黑色素提取得率影响的响应面和等高线图。由图3-C可知，酶解pH在5.0～6.0，酶解温度在30～40 ℃时，黑色素提取得率呈先增后减的趋势。酶解pH曲面较酶解温度曲面平缓，说明酶解pH对黑色素提取得率的影响较大。

(3)酶添加量与酶解温度的交互作用。图3-E,F为酶解pH为5.5时，酶添加量与酶解温度对黑色素提取得率影响的响应面和等高线图。由图3-E可知，酶添加量在20～30 mg/g，酶解温度在30～40 ℃时，黑色素提取得率呈先增后减的趋势。酶添加量曲面较酶解温度曲面平缓，说明酶添加量对黑色素提取得率的影响较大。

综上可知，酶添加量对黑木耳黑色素提取得率影响最大，其次为pH,酶解温度影响相对较小，与方差分析结果一致。

2.3.4 优化条件验证 预测该模型的最优提取条件为：复合酶添加量25 mg/g，酶解pH 5.96，酶解温度32.68 ℃，在此条件下，黑色素提取得率可达到13.20%。为了对模型进行验证，并且便于操作，实际提取条件为：复合酶添加量25 mg/g，酶解pH 6.0，酶解温度33 ℃，对黑木耳黑色素进行3次提取验证，实际提取得率为13.80%。在25 mg/g酶添加量下，该提取得率分别是纤维素酶(6.80%)、果胶酶(7.25%)和木瓜蛋白酶(10.13%)(图1)单一处理组的2.03，1.90和1.36倍。

2.4 黑木耳黑色素的红外光谱

用红外吸收光谱对天然黑色素进行分析和鉴定，能有效对其化学键进行表征。如图4所示，复合酶提取的黑木耳黑色素红外光谱中，3 298.40 cm-1处有强而宽的吸收峰，表明存在-NH和-OH结构；2 926.13cm-1处的尖峰对应脂肪族C-H基团，表明有CH2CH3存在；1 652.71 cm-1处的特征吸收对应于C=O伸缩振动或芳香环的C=C伸缩振动；1 540.00 cm-1处的N-H弯曲振动和1 402.39 cm-1的C-N伸缩振动，表明该黑色素具有典型的黑色素吲哚结构；627.45 cm-1处吸收带较弱，意味着芳香环已被取代形成共轭体系。

2.5 黑木耳黑色素的抗氧化活性

如图5所示，以VC作为阳性对照，黑木耳黑色素在一定质量浓度范围内对DPPH、ABTS和OH自由基的清除能力呈剂量依赖性。其中，黑木耳黑色素对DPPH和ABTS自由基的清除效果较好，其EC50值分别为1.62，0.99 mg/mL。同时，黑木耳黑色素对OH自由基的EC50值为4.44 mg/mL。当黑色素质量浓度为2 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率与VC无显著差异，高达(98.95±2.08)%，表明复合酶提取的黑木耳黑色素具有良好的抗氧化活性。

3 讨论与结论

黑色素通常只溶于碱性溶液，传统上一般采用碱溶酸沉法提取[15]，但存在提取得率低、提取周期长等问题。为提高黑木耳黑色素的提取效率，李琦等[15]采用碱提法对黑木耳黑色素进行提取，获得黑色素粗品得率2.26%。张莲姬等[24]采用盐酸浸提法提取获得的黑色素得率为2.70%；李琦[25]又采用超声法辅助氢氧化钠提取法，最终黑色素得率为9.10%；张艳荣等[26]采用碳酸钠提取，得到黑木耳黑色素粗提物得率为9.078%；宋丹靓敏等[27]采用超声微波辅助提取黑木耳黑色素，黑色素得率为9.10%；侯若琳等[6]采用纤维素酶辅助超声波提取法提取黑木耳黑色素，得率为10.48%。本试验采用复合酶提取黑木耳黑色素，其操作简单，周期较短，提取效率高。响应面优化的最佳提取参数为：纤维素酶/果胶酶/木瓜蛋白酶复合酶添加量25 mg/g，酶解pH 6.0，酶解温度33 ℃，三者酶质量比1∶3∶0，液料比20∶1，酶解时间60 min。在此条件下，黑色素实际提取得率可提高至13.80%，表明纤维素酶和果胶酶协同提取黑木耳黑色素能有效促使黑木耳细胞壁破裂，加速黑色素大量浸出，具有广泛的开发和应用潜力。

综上，纤维素酶协同果胶酶提取可以显著提高黑木耳黑色素得率，其得率高达13.80%。同时，所得黑色素具有良好的抗氧化活性，该方法可用于高效提取黑木耳黑色素。