鸡蛋中维生素B1的含量检测

武传香，薛霞，卢兰香，魏莉莉，丁一，刘艳明*

1.山东省食品药品检验研究院（济南 250101）；2.山东省食品药品安全检测工程技术研究中心（济南 250101）；3.山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心（济南 250101）

鸡蛋作为生活中必不可缺的食品，因其具有较高的营养价值一直深受广大消费者的喜爱[1-2]。目前市场上鸡蛋种类繁多，如山鸡蛋、草鸡蛋、洋鸡蛋，乌鸡蛋，土鸡蛋等，各类鸡蛋的营养价值成为了评定其价格高低的重要指标[3-4]。2019年的3·15晚会指出，标称土鸡蛋、柴鸡蛋、笨鸡蛋的价格比普通散装鸡蛋（洋鸡蛋）高出不少，有的甚至高出一两倍，但对其营养价值的高低缺乏评价。其中维生素B1（VB1）作为鸡蛋中重要的营养物质[5-10]，研究鸡蛋中维生素B1的含量对评价各类鸡蛋中营养价值是否存在差异具有重要的理论价值和现实意义。维生素B1（VB1），又称硫胺素或抗神经炎维生素，化学式C12H16N4OS（HCl），是由嘧啶环和噻唑环结合而成的一种B族维生素。VB1具有维持人体正常代谢和生长发育的作用，是人体不可或缺的营养元素[11-13]，成人每天需摄入1～2 mg。VB1在食物中有三种形式[14]，即游离形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸复合物。

目前，VB1的测定方法主要包括荧光分光光度计法[15-16]、微生物法、高效液相色谱法（HLPC）[17-25]和液相色谱-串联质谱法（HLPC-MS）[26-27]等。荧光分光光度计法耗时、费力，已难以满足当前分析要求和发展趋势[15]，不适用于检测更微量的样品[16]。微生物法和液相色谱法比较常用，虽然微生物法检测成本低，具有较高的灵敏度和精确度，但步骤繁琐、检测周期长、重复性差，不适用于在较短时间内检测大量样品[28]。基于实验室一般条件，HLPC-MS起点较高，所以本研究采取高效液相色谱法进行鸡蛋样品检测。目前不同基质中VB1前处理方法有沉淀蛋白法和GB 5009.84—2016（第一法）中样品酸解和酶解的方法。鸡蛋含有大量的维生素、矿物质和蛋白质，基质复杂，目前有必要优化样品前处理方法，建立一个快速、灵敏、准确的鸡蛋中VB1的检测方法。试验采用高效液相色谱-荧光法对从市场上采集的不同品牌的60个鸡蛋中VB1进行测定。通过优化样品前处理及色谱条件，建立一种高效、灵敏、准确的检测方法，分析了市售不同品种鸡蛋中的VB1的含量差异，取得了较好的效果，提高了检测效率和结果的准确性。

1 试验部分

1.1 材料与仪器

硫胺素盐酸盐（纯度≥98.6%，Bepure）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团有限公司）；正丁醇（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活力≥6 000 U/mg，国药集团有限公司）；alpha-淀粉酶（酶活力≥1 500 U/g，美国Sigma公司）；试验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。鸡蛋均购自山东省各大超市。方法优化采用的鸡蛋经GB 5009.84—2016（第一法）测定结果为1.125 mg/kg。

Agilent 1260高效液相色谱仪配备荧光检测器（美国安捷伦公司）；pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；Milli-Q超纯水制备器（美国Millipore公司）；AB-204S型电子天平（瑞士mettler Toledo公司）；SB-800DTD数控超声波清洗器（中国宁波新芝生物科技有限公司）；MS3涡旋混合器（德国IKA公司）；GM-300型粉碎机（德国莱驰公司）。

1.2 液相仪器条件

色谱柱：Xbridge C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：0.01 mol/L乙酸钠溶液-甲醇（80∶20）；荧光检测器：激发波长375 nm，发射波长435 nm；流速：0.7 mL/min；进样体积：20 μL；柱温：35 ℃。

1.3 标准溶液的配制

标准储备液（500 μg/mL）：准确称取5.00 mg的硫胺素盐酸盐于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L的盐酸溶液溶解并定容至容量瓶刻度。

标准工作溶液：将标准储备液用水逐级稀释为1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 ng/mL的系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

1.4.1 提取方式

VB1在食物中有三种形式[14]，即游离形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸复合物，结合态VB1必须采用酸解或酶解得到游离态，游离态可以直接沉淀蛋白后测定，因此试验分别考察了沉淀蛋白法、酶解、酸解及其组合模式对鸡蛋中VB1的提取效果（图1和图2）。

1) 酶解法：称取5 g粉碎均匀的鸡蛋液体于100 mL锥形瓶中，加入适量温水溶解混匀后，加入0.5 g淀粉酶和0.5 g木瓜蛋白酶，在55 ℃条件下酶解30 min后冷却至室温，用2.0 mol/L乙酸钠溶液调pH至4.0±0.2。

2) 酸解法：称取5 g粉碎均匀的鸡蛋液体于100 mL锥形瓶中，加60 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞上塞子，在120 ℃条件下酸解20 min，冷却至室温后取出，用2.0 mol/L乙酸钠溶液调pH至4.0加减0.2。

3) 酸解酶解法：样品经与（2）相同的方式酸解后，加入3 mL蛋白酶-淀粉酶混合液（分别称取1.27 g淀粉酶和1.76 g木瓜蛋白酶，加水定容至50 mL，混匀），在37 ℃条件下酶解16 h后，冷却至室温。

4) 沉淀蛋白法：称取5 g粉碎均匀的鸡蛋液体于100 mL锥形瓶中，加入适量温水溶解混匀后，选择4种不同的沉淀蛋白法（乙酸锌-亚铁氰化钾沉淀法、5%三氯乙酸沉淀法、甲醇沉淀法、等电点沉淀法）进行沉淀，然后调节试样溶液的pH至4.0±0.2。

以上四种处理方式后，试样溶液转移至100 mL容量瓶中，用水冲洗锥形瓶，洗液合并于容量瓶中，并用水定容至刻度，摇匀后经滤纸过滤，滤液待衍生。

1.4.2 衍生

样品衍生：准确移取上述滤液5 mL于50 mL离心管中，加入3 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后，准确加入5 mL正丁醇，涡旋混匀1.5 min后离心，吸取正丁醇相（上层）经0.45 μm有机微孔滤膜过滤后，供液相色谱仪分析用。

标准溶液衍生：步骤与样品衍生相同。

2 结果与分析

2.1 提取方式的选择

1.4.1 小节中采用四种不同的样品提取方法，测得鸡蛋不同提取方法中的VB1含量和回收率分别见图1和图2，样品加标水平为1.00 mg/kg。结果显示（图1和图2），亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀法测定的鸡蛋中的VB1明显偏低，且回收率低于10%，原因可能是鸡蛋中部分VB1被这种沉淀法一起包裹沉淀；除亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀法外，其他三种沉淀蛋白法测得的鸡蛋中VB1含量和回收率均低于其他三种样品提取法（酶解、酸解及其组合模式）；只有酸解法和酸解+酶解法的滤液澄清，衍生后分层明显，无乳化现象，其他几种提取方法均出现不同程度的乳化现象，原因可能是高温酸解不仅可以水解蛋白，还有沉淀蛋白等净化作用。酸解法和酸解+酶解法都经过了高温酸解，因此滤液澄清，结果无差异。考虑到酸解+酶解法，不仅增加检验成本，而且增加了检验周期，所以选择酸解的提取方式。

图1 不同提取方式对鸡蛋中VB1含量的影响

图2 不同提取方式对鸡蛋中VB1回收率的影响

2.2 提取条件的优化

2.2.1 盐酸浓度的优化

考察了HCl不同浓度（0.01，0.05，0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L）对鸡蛋样品中VB1的提取效果。结果显示，不同浓度的HCl对VB1的提取效果差异不大，当浓度为0.1 mol/L时，测得鸡蛋中VB1的含量最高，所以选择HCl浓度为0.1 mol/L。

2.2.2 酸解温度的优化

考察了温度为30，60，90，120，150和180 ℃对VB1提取效率的影响。研究发现，不同温度对VB1的提取效果差异不大，当温度低于120 ℃时，样品酸解溶液浑浊难以过滤，且衍生后有严重的白色乳化现象。鉴于试验安全，所以选择最佳酸解温度为120 ℃。

2.2.3 酸解时间的优化

酸解时间是影响VB1提取的重要因素之一，分别考察了酸解时间为10，20，30，40，50和60 min对提取效果的影响（图3）。结果表明，40 min内，VB1的提取效率相同，40 min后开始有下降趋势。由于酸解10 min，样品酸解溶液不易过滤，所以选择最佳酸解时间为20 min。

图3 不同酸解时间对VB1提取的影响

2.3 色谱条件优化

2.3.1 色谱柱的选择

试验比较了Xbridge C18柱（4.6×150 mm，3.5 μm）、Atlantis C18柱（4.6×150 mm，5 μm）和Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6×150 mm，4 μm）三种色谱柱的分离效果。结果表明，在选定的条件下Xbridge C18保留分离效果最好，峰型对称，且峰宽小。原因可能是VB1结构式含有羟基和氨基，衍生后显碱性，而Xbridge C18专有的端基封尾技术可以确保碱性化合物具有完美的色谱峰形，所以试验最终选择Xbridge C18色谱柱进行分离分析。

2.3.2 流动相的优化

2.3.2.1 流动相种类的选择

经相关文献[21, 29]调研，高效液相色谱中比较常用的流动相一般为甲醇-乙酸钠、甲醇-乙酸铵或甲醇-磷酸盐缓冲溶液，但由于甲醇-磷酸盐缓冲液体系中磷酸盐容易造成色谱柱堵塞，所以为了保护色谱柱，选择甲醇-乙酸钠和甲醇-乙酸铵缓冲溶液进一步优化。试验采用处理后的鸡蛋样品上机溶液，考察了在pH 4.0条件下10 mmol/L乙酸铵和10 mmol/L乙酸钠对VB1分离效果的影响。结果显示（见图4A）：流动相为乙酸铵时，峰型展宽，拖尾因子是0.86，峰轻度前伸；流动相为乙酸钠时，峰宽变窄，峰形变好，呈现高斯对称，所以试验选择乙酸钠作为后续流动相的优化。

2.3.2.2 流动相浓度的选择

鸡蛋样品按照2.4小节进行样品处理，将流动相分别配成5，10，30和50 mmol/L乙酸钠（pH 4.0），比较VB1分离效果和峰型差异。结果可见（见图4B）：浓度为5 mmol/L时，VB1峰型展宽，峰前伸；浓度为10，30和50 mmol/L时，VB1的峰型差异不大，峰型较好；考虑到高浓度的盐会对色谱仪的输液泵和色谱柱的寿命产生影响，所以试验选择乙酸钠的最佳浓度为10 mmol/L。

2.3.2.3 流动相pH选择

相关文献[22]调研，可通过调节流动相的pH来影响其在色谱柱上的保留时间。试验探讨了在相同的流动相组成、比例以及流速条件下，改变流动相pH：采用pH分别为2.0，4.0，6.0，8.0的10 mmol/L乙酸钠溶液作为流动相进行等度洗脱，考察流动相pH对VB1分离的影响。结果显示（见图4C），随着流动相pH变大，VB1出峰时间延后，反之出峰时间提前；当pH为2.0时，VB1的峰变宽，峰型很差且响应低；当pH为4.0，6.0和8.0时，VB1峰宽变窄，峰型对称。由于样品前处理中有VB1衍生过程，其色谱峰图谱基本无杂峰，考虑到分离效率，试验最终选择流动相的pH为4.0。

图4 流动相的优化

2.4 方法学评价

2.4.1 线性范围、检出限和定量限

将2.3小节中1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 ng/mL的标准工作溶液按照1.4.2小节衍生后，按照1.2小节的液相色谱条件进行测定，以VB1峰面积（Y）对其质量浓度（X）做标准曲线，得到线性方程为Y=46.632 9X-0.221 5，相关系数（R2）大于0.999，线性关系良好。样品按照1.4小节处理后，逐级稀释成不同浓度VB1溶液后，经液相色谱仪进行测定，测试其信噪比，分别确定检出限和定量限。以信噪比S/N=3得到目标物的检出限（SLOD）为0.015 mg/kg，以信噪比S/N=10得到目标物的定量限（SLOQ）为0.050 mg/kg。标样谱图（图5 A）和样品谱图（图5 B）见图5。

图5 标准溶液（100 ng/mL）色谱图（A）和样品色谱图（B）

2.4.2 回收率

将同一份鸡蛋样品分成2份，其中一份作本底，另一份添加适量浓度的VB1标准溶液后按照文章建立的方法进行处理和测定，每份样品进行6次平行测定，考察方法的回收率和精密度，结果见表1。样品加标回收率为95.5%～102.0%，相对标准偏差（SRSD）为1.10%～3.21%，可见方法的数据稳定，重现性良好。

表1 方法的回收率与精密度（n=6）

2.4.3 精密度

不同种类鸡蛋样品（山鸡蛋、草鸡蛋、洋鸡蛋、乌鸡蛋、土鸡蛋）随机选取一个进行精密度测定，每个样品分别平行取样6组，按照1.4小节进行样品处理，上机测定。样品中的VB1含量及精密度见表2。结果显示，精密度小于1.53%，试验数据稳定。

表2 鸡蛋中VB1的含量及精密度

2.5 实际样品分析

应用此方法对市售的60个不同名称鸡蛋样品（包括12个山鸡蛋、12个草鸡蛋、12个洋鸡蛋、12个乌鸡蛋、12个土鸡蛋）进行检测，通过标准曲线计算其中VB1的含量，检测结果如下：山鸡蛋、草鸡蛋、洋鸡蛋、乌鸡蛋、土鸡蛋含量范围分别为0.121～0.872，0.288～0.808，0.185～0.886，0.316～0.758和0.293～1.15 mg/kg。结果表明：鸡蛋中均含有VB1，含量范围较宽：0.121～1.15 mg/kg；从60批市售鸡蛋样品结果来看，不同种类鸡蛋之间VB1含量无明显差异。

2.6 此方法与国标方法的比较

用此方法和国标法（GB 5009.84—2016）中的第一法同时测定鸡蛋样品，进行比对试验。样品结果及加标回收率见表3。结果显示鸡蛋样品中的VB1含量和国标法测得的结果基本一致，回收率比较满意，最大相对偏差为3.56%，因此该方法可以用于鸡蛋中VB1的检测。

表3 国标法与本方法的比对结果（n=6）

3 结论

试验建立了鸡蛋中维生素B1的含量检测研究方法。样品经HCl高温酸解提取无需酶解过夜，不仅节约了成本，提高了检验效率，而且酸解还有沉淀蛋白的净化作用。该方法不仅前处理简单，而且具有较高的灵敏度，检出限为0.015 mg/kg，定量限为0.050 mg/kg；具有较宽的线性范围：1～500 ng/mL；具有较好的加标回收率：95.5%～107.8%，可适用于大批量样品的处理检测。研究对准确测定鸡蛋中维生素B1含量提供了技术支持；对研究不同种类鸡蛋品质和营养价值的差异，具有重要的理论价值；对消费者进行鸡蛋消费选择具有重要的现实意义。