黑老虎果实不同部位次生代谢成分及其富集差异

高渐飞，周 玮，文锡梅，杨 艳

（1.贵州科学院，贵州省山地资源研究所，贵州贵阳 550001；2.贵州工业职业技术学院，贵州贵阳 550008；3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550014）

黑老虎（Kadsura coccineaLem.）又名冷饭团、布福娜、大叶五味子等，南五味子属五味子科植物；分布于贵州、广西、云南等地。其根为常用中药[1-2]，现代科学研究显示，其还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗HIV、保肝等活性作用[3-6]。黑老虎果实为聚合果，外形奇特、被誉为“神奇之果”[7]；果肉似荔枝、口味独特，单果重100～580 g。近10年来，被作为一种新型水果种植，但果实可食率较低、果皮较厚（占果重的32%～50%）、种子多（100～210粒，占果重的7%～10%），果肉-种子不易分离[8-9]，不耐贮运等严重制约着更进一步发展。对果实和果实副产物（果皮和种子）进行精深加工利用已成为解决其瓶颈的途径之一[8-10]。果实中的次生代谢物是主要活性物质，决定着品质及其加工产品的功能活性[11]，了解其多样性与富集格局对下一步的研究与开发利用非常重要。

当前研究显示，果实中含苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等近20种氨基酸[9,12-13]，含8种饱和脂肪酸和4种不饱和脂肪酸[14]；维生素C、粗蛋白质、可溶性糖等常规营养成分及其钙、铁、锌、镁等微量元素优于龙眼、草莓、荔枝等水果[8,12]，证实果实有较高的营养和保健价值。而关于活性物质的鉴定，研究者主要关注该植物的根茎部位，已鉴定出木脂素和萜类202种[7]。广泛靶向代谢组学能通过高通量化学分析技术对生物样品中代谢产物进行定性和定量分析，已得到广泛认可[14-16]。然而，目前关于黑老虎果实不同部位次生代谢物鉴定及其富集差异的研究报道较少。

本研究以黑老虎果实为材料，利用广泛靶向代谢组学方法，超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）技术，高通量、高灵敏、广覆盖检测果肉、果皮和种子的代谢物，解析其中的次生代谢成分，分析其在不同部位多样性与富集差异，探究特有和高度富集成分，为在药食领域开发利用提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑老虎果实 人工培育的6年植株所结，栽植于覆盖80%遮阳网的塑料大棚，定期管理、长势良好，于2020年10月11日随机采摘数十株成熟果实，并选果型端正，果大（单果重＞250 g）的作为样品，采样地位于贵州省贵阳市乌当区下坝镇普渡村。

SHIMADZU Nexera X2超高效液相色谱仪日本岛津公司；Applied Biosystems 4500 QTRAP三重四级杆质谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；SBC18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美国安捷伦公司；MM 400研磨仪 Retsch。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 果实经自来水洗净后纯净水冲洗3次，将其分离成小浆果，置于小板上、用手术刀剖开剥离出果肉、果皮，用砂布包裹揉搓种子使其干净，分别装入10 mL离心管中。编号为果肉KF1-3，果皮KP1-3和种子KD1-3；然后迅速置于液氮中，随后干冰保存转运至-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

将3组供试样品放置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥，用研磨仪研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；准确称取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中；每30 min涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6次，样本置于4 ℃冰箱过夜；离心（转速12000 r/min，10 min）后，吸取上清，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，并保存于进样瓶中用于分析。

1.2.2 色谱质谱采集条件 液相条件：色谱柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脱梯度：0.00 min B相比例为5%，9.00 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10.00～11.10 min，B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL/min；柱温40 ℃；进样量4 μL。

利用AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系统（配备了ESI Turbo离子喷雾接口）检测电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI），由Analyst 1.6.3软件（AB Sciex）控制运行[17]。ESI源操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设置为50、60和25.0 Psi，参数设置为高。

1.3 样本质控

质控样本（Quality Control Samples，QC）由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每3个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。

1.4 数据处理

基于迈维（武汉）生物技术有限公司MVDB V2.0数据库和代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性，采用三重四极质谱多反应监测模式（Multi Reaction Monitor，MRM）对代谢物进行定量。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，利用软件Analyst 1.6.3对物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正。

根据正交偏最小二乘法判别模型（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）分析代谢组数据，进一步展示各组分之间的差异[18]。评价模型的预测参数有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力，这3个指标越接近于1时表示模型越稳定可靠，Q2＞0.5时可认为是有效的模型，Q2＞0.9时为出色的模型。基于OPLS-DA结果，从获得的多变量分析OPLS-DA 模型的变量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP），选取VIP≥1，fold change≥2 和fold change≤0.5 的代谢物为差异代谢物（Differentially Accumulating Metabolites，DAMs）。

2 结果与分析

2.1 次生代谢物的多样性与丰度

在黑老虎果实中检测出次生代谢成分共307个，其中果皮含272个、果肉286个、种子201个，3个部位相同180个。基于结构配置对其进行归类，数量上以酚酸类化合物最多，占38.8%；其余依次是黄酮（27.7%）、木脂素和香豆素（13.4%）、萜类（10.4%）、生物碱（5.2%）、单宁（4.6%）。种子中酚酸、黄酮和萜类化合物数量明显低于果肉和果皮，导致其次生代谢物多样性不如二者（图1）。

图 1 黑老虎果实不同部位（果肉、果皮、种子）次生代谢物分布Fig.1 Distribution of secondary metabolites in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

通过值峰积累分析（图2），次生代谢物丰度在3个部位呈现出明显差异，果皮中丰度高达81.62×107，分别是果肉（25.61×107）和种子（24.38×107）的3倍多。这得益于果皮中类黄酮的高度富集，生物碱显著上调，同时酚酸、单宁和萜类也都向上表达。黄酮类的显著积累及酚酸的上调可能是果皮的一些活性，如抗氧化、抑菌和抑酶优于果肉和种子的物质基础[19]。而果皮中积累了不少单宁，可能是口感苦涩的原因之一。

2.2 差异代谢组分

2.2.1 主成分分析 通过对样本进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），判别黑老虎果肉（KF1-3）、果皮（KP1-3）、种子（KD1-3）各样本组之间及组内次生代谢物变异度大小。样本PCA得分图（图3）显示LC-MS分析所得原始数据在 PC1、PC2 两种主成分中得到良好地呈现。在图中，第1主成分的贡献率为68.5%，第2主成分的贡献率为24.3%，代表2个主成分能够基本反映检测样的主要特征信息；样本表现出明显的分离趋势，表明对各样本数据处理结果可信，各样本间存在明显差异。

图 2 黑老虎果实不同部位（果肉、果皮、种子）次生代谢物丰度Fig.2 Abundance of the secondary metabolites in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

图 3 样本 PCA 得分图Fig.3 PCA score chart of total samples

2.2.2 OPLS-DA结果 为了鉴别出具体有哪些组分造成了分离现象，建立黑老虎果皮与果肉（KF vs KP）、果肉与种子（KF vs KD）之间的2组OPLS-DA 模型。2组比较OPLS-DA验证结果显示，模型具有很好的预测能力和可靠性，能够很好地表现各组间代谢物的变化趋势；对OPLS-DA 模型进行 200 次排列验证，模型有意义（表1），可根据 VIP 值分析筛选其DAMs。

表1 2组比较的OPLS-DA 模型验证值Table 1 The calculated OPLS-DA model values of the two pairwise groups

2.2.3 差异组分 根据DAMs选择标准，KF vs KP筛选到175个DAMs， KF vs KD 有236个DAMs，2对照组中的DAMs都主要为酚酸和类黄酮。由于来自酚酸、木脂素和香豆素、萜类的DAMs数量远多于KF vs KP，这使得KF vs KD有更多数量的DAMs。KF vs KP 中的DAMs以上调模式占主导，而KF vs KD中则以下调为主。2对照组中都为DAMs 的有129个，其中类黄酮数量最多（47个）、酚酸次之（37个）（表2）。由此可知，黑老虎果皮、果肉和种子之间显著差异的代谢组分主要为类黄酮和酚酸成分。

表2 差异代谢物组成Table 2 Number of differentially accumulated metabolites and classes

2.3 特征和高度富集成分

2.3.1 木脂素 木脂素类成分认为是五味子属植物的主要药效成分，是五味子属植物的重要化学标志物[20]。在黑老虎果实中共鉴定出木脂素类化合物36个，其中种子中最多（31个），果肉居中（26个），果皮最少（19个），3个部位共有14个（表3）。木脂素在3个部位的富集量差异较大，在果皮中丰度为2.09×107，果肉下降至0.70×107，在种子显著上调达19.08×107。积累量较高的代谢物多来自种子（有的属种子特有），且多个被证实具有重要活性作用。如狭叶南五味子素 E、狭叶南五味子素 G对HIV-1有抑制活性[21]，日本南五味子木脂素G具有抗NO生成活性[22]，Kadusurain C对4种人肿瘤细胞（A549、HCT116、HL-60和HepG2）具有抗增殖作用[23]，日本南五味子木脂素 C对HepG-2人肝癌细胞具有较强的细胞毒活性，IC50值为9.92 μmol/L[24]。

表3 黑老虎果实不同部位（果肉、果皮、种子）木脂素成分及丰度Table 3 Abundance of lignans detected in in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

2.3.2 类黄酮 黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，是药用植物的主要活性成分之一，具有多种生物活性和药理作用，在药物开发和食品保健领域有广泛应用前景。在黑老虎果实中鉴定出类黄酮85个，果肉、果皮和种子分别含71个、85个和52个，3个部位共有51个。类黄酮在果皮中高度富集，丰度高达46.88×107，分别是果肉（6.29×107）和种子（0.29×107）的7倍和159倍。进一步将类黄酮分为查耳酮、二氢黄酮、黄酮醇、黄烷醇类、花青素、黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷8个亚类（表4），其中，黄酮和黄酮醇数量超过其他6类之和。果肉和果皮中黄酮醇和花青素数量大幅度多于种子，这使得其类黄酮多样性更丰富。而花青素、黄酮醇、黄酮、黄烷醇类在果皮中显著向上积累，从而使果皮富含类黄酮；同时，由于它们在3个部位中富集不均衡，导致其黄酮类成分丰度呈现显著差异。

表4 黑老虎果实不同部位（果肉、果皮、种子）类黄酮成分及丰度Table 4 Abundance of flavonoids detected in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

续表3

续表4

进一步发现，类黄酮在3个部位中丰度差异主要是受槲皮素、儿茶素和矢车菊素类成分的向上或向下积累影响。这些成分在果皮中高度富集，尤其槲皮素及衍生物积累量分别是果肉和种子的100和1000余倍。槲皮素、儿茶素虽然造成口感苦涩，但其有重要活性作用。据报道，槲皮素及衍生物具有优异的抗氧化特性，在神经系统疾病、炎症、肝脏疾病、心血管疾病、细菌和真菌感染、抗癌等疾病中具有重要药理作用[25-27]，对维持人体健康至关重要。儿茶素具有抗炎症、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，还可预防心脑血管疾病，以及保护肾脏、肝脏和神经系统等[28-31]。表明，黑老虎果皮作为生物类黄酮原料，具有较高潜在利用价值。

2.3.3 萜类 黑老虎因含有结构多样和新颖的三萜，从而广受关注[7]。在果实中鉴定出的32个萜类化合物，含倍半萜、二萜、萜类、倍萜、三萜和三萜皂苷6个亚类，其中三萜数量最多（24个）。果皮（30个）和果肉（28个）中的数量远高于种子（14个），主要因含有更多数量的三萜（表5）。同时，受三萜表达量下调的影响，萜类化合物在果皮（2.94×107）、果肉（1.80×107）、种子（1.31×107）中的丰度逐渐下降。鉴定出的萜类化合物中Kadcoccilactone A积累量最高，但仅种子中含有；其余富集较高的还有南五味子酸 D、Kadcoccitone C、Kadcotrione A等。此外，三个部位中都鉴定出Kadcoccilactone Q和Kadcoccilactone U，据报道这类结构新颖的三萜化合物只在黑老虎植物中发现过[32]。Liang等[33]报道kadcotrione A和具有抗HIV-1活性，EC50值为47.91 μg/mL；kadcoccitone B显示出抗HIV活性，EC50值为30.29 μg/mL[34]；kadcoccinone C对6种人类癌症细胞系（HL-60、SMMC7721、A-549、MCF-7、SW-480和Hela）具有细胞毒活性[35]。同样表明黑老虎果实中萜类化合物具有明显的研究和利用价值。

表5 黑老虎果实不同部位（果肉、果皮、种子）萜类成分及丰度Table 5 Abundance of terpenoids detected in different parts(pulp, peel and seed) of Kadsura coccinea fruit

3 结论

利用超高效色谱和串联质谱技术在黑老虎果实中共检测出307个次生代谢物，数量上以酚酸和黄酮类占主导。果皮、果肉和种子次生代谢物多样性和丰度呈现出明显差异，果肉和果皮中酚酸、类黄酮（黄酮醇和花青素）、三萜化合物（三萜）数量高于种子，从而使其多样性优于种子。类黄酮（花青素、黄酮醇、黄酮、黄烷醇）在果皮中高度富集，生物碱上调，使其次生代谢物丰度远高于果肉和种子。3个部位显著差异代谢组分主要为酚酸和黄酮类化合物。

果皮中根皮素及衍生物、儿茶素及衍生物和花青素等类黄酮化合物高度富集，种子中则积累了较高的木脂素，这两个部位都分别含有多个独特成分；此外，果皮、果肉和种子中都鉴定出一些结构新颖的三萜化合物。这些高度富集和特有成分具有较高利用价值。由于次生代谢物受植物生长微环境及外界复杂环境等综合影响，今后还需扩大测试样本，如增加不同产地、不同种植模式和方式、不同树龄等的比较分析，为黑老虎果实的开发和利用提供参考。