黄花菜多糖的表征与抗氧化活性分析

刘艺珠，刘佩冶，赵玉梅，曹建康,

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京工商大学化学与材料工程学院，北京 100048）

黄花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）为阿福花科萱草属植物，在我国南北各地均有栽培。黄花菜营养丰富，含有多糖、类胡萝卜素、类黄酮和维生素等多种生物活性物质，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化等活性[1]。

目前，对黄花菜多糖的研究引起了学者的广泛关注。黄花菜多糖可采用水提醇沉法、微波提取法、超声波提取法、微波处理-水提醇沉法和超声波处理-水提醇沉法等进行提取，以微波提取法效果最佳[2]。紫外扫描结果表明多糖几乎不含核酸和蛋白质，红外光谱显示黄花菜多糖粗品主要为杂果聚糖[3]。黄花菜多糖具有较强的体内抗肿瘤活性[4]，其机制可能与多糖能够提高机体的免疫功能有关。黄花菜粗多糖含量随乙醇提取浓度的升高而增加，对H2O2和·OH自由基的清除效果也明显增强[5]。黄花菜粗多糖是一种具有α-型吡喃糖苷结构的水溶性杂多糖，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌具有明显的抑制作用[6]。这些研究表明黄花菜多糖具有较高的应用价值，但是，对黄花菜多糖的组成和特征仍缺乏系统的研究。

基于此，拟采用硝酸调节水pH至1.8从干黄花菜中提取多糖，研究黄花菜多糖的组成、微观结构、分子表征，并系统分析其抗氧化能力，以期为黄花菜多糖功能产品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干黄花菜 产于湖南祁东，将干黄花菜在80 ℃烘干约8 h至恒重，粉碎，黄花菜粉末保存于干燥器内待用；透析袋 截留分子量为10 kDa，购于美国MYM生物科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2-联氮-二（ 3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、2, 4, 6-三吡啶基-S-三嗪（TPTZ） 美国Sigma试剂公司；优级纯的硝酸等常规试剂 北京试剂公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝 G-250等 北京化学试剂公司；葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、岩藻糖、氢氧化钠、乙酸钠、葡聚糖标准品 色谱纯，Sigma公司。

LGJ-10B 冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；YB-300 高速多功能粉碎机 永康市速锋工贸有限公司；AgiLent TechnoLogies 1260体积排阻色谱 美国AgiLent科技有限公司；PE-SP100红外光谱仪 美国PerkinELmer公司；YP-2 压片机及模具 上海山岳科学仪器有限公司；S-3400N 扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；IB-3溅射镀膜仪 日本Eiko公司；TA60W差热-热重同步分析仪 日本岛津公司；AR 1500流变仪 美国TA仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的提取与制备

1.2.1.1 多糖的提取 参考宋贤良等[7]的方法略有修改。量取475 mL蒸馏水，用GR优级纯的硝酸调节pH至1.8，加入25 g黄花菜粉，在75 ℃下振荡提取3.5 h。在8000 r/min离心10 min，收集上清液。用4～5倍的95%乙醇和上清液混合至乙醇终浓度为80%得到絮状沉淀。将絮状沉淀用95%乙醇洗涤沉淀两次，再用丙酮洗涤两次除去脂肪和色素类物质。最后将洗涤后的沉淀用真空干燥箱在40 ℃下干燥即可得粗多糖，测定、计算粗多糖的得率。

1.2.1.2 Sevag法脱除蛋白 用60 ℃热水将得到的粗多糖配成10 mg/mL的溶液，磁力搅拌30 min后，置于4 ℃下过夜，使样品充分溶解。加入等体积的Sevag试剂（V氯仿:V正丁醇=4:1），充分振摇25 min。在4000 r/min离心10 min，弃去下层变性蛋白沉淀，重复3次。把得到的上清液用截留量为10 kDa的透析袋透析3 d，在-40 ℃真空冷冻干燥，得脱除蛋白的多糖，在干燥器内保存备用，用于组分分析、表征和抗氧化活性的研究。

1.2.2 多糖组成分析

1.2.2.1 多糖含量测定 采用蒽酮比色法测定[8]。多糖含量以每克多糖组分所含有的葡萄糖毫克数表示，重复3次。

1.2.2.2 半乳糖醛酸含量测定 采用咔唑比色法测定[8]。GalUA含量以每克多糖组分中所含有的GalUA毫克数表示，重复3次。

1.2.2.3 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝染色法[9]。蛋白质含量以每克多糖组分所含有的蛋白质毫克数表示，重复3次。

1.2.2.4 甲酯化程度测定 参考Virk等[10]的方法略有修改。量取20 mL 0.5%（w/v）的多糖溶液，加入80 mL去CO2水，充分溶解。以酚酞试剂作为指示剂，用0.05 mol/L NaOH滴定至颜色变成粉红色时，向溶液中再加入15 mL 0.25 mol/L NaOH，在室温下搅拌30 min以水解酯键。再加入15 mL 0.25 mol/L盐酸以中和溶液。然后，用0.05 mol/L NaOH再次滴定至粉红色，重复3次。DM的计算公式为：

式中：DM为甲酯化程度，%；V1为第一次所用NaOH的体积，mL；V2为第二次所用NaOH的体积，mL。

1.2.2.5 单糖组成分析 采用高效阴离子交换色谱分析法[11]。称取黄花菜多糖10 mg置于水解管中，加入4 mL 2 mol/L的三氟乙酸，充氮1 min以排出管内空气，旋紧螺旋盖，于120 ℃水解1 h，待冷却后用氮气吹干水解液，以除去过量的三氟乙酸，加超纯水定容至10 mL。稀释后，用0.2 μm滤膜过滤，进离子色谱仪分析。

色谱条件：分析柱：Carbo PacTMPA10 4×250 mm analytical；洗脱液：200 mol/L NaOH和1 mol/L NaAc；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：35 ℃；检测器：脉冲安培检测器，金电极。梯度洗脱条件：A为水，B为200 mol/L NaOH，C为1 mol/L NaAc；0～20 min，91% A，9% B，0% C；20～20.1 min，86% A，9% B，5%C；20.1～35 min，71% A，9% B，20% C。用5 mg/L的混合单糖通过外标法制作标准曲线，单糖含量以μg/mL表示，重复3次。

1.2.3 多糖结构与表征

1.2.3.1 扫描电镜观察 将黄花菜多糖粘在双面胶台上，用溅射镀膜仪在样品上镀上金膜，扫描电镜观察。

1.2.3.2 FTIR分析 将溴化钾于105 ℃干燥6 h，取200 mg溴化钾于玛瑙研钵中作空白样，充分研磨，置于压片模具中，用压片机压制，压力在25 MPa左右保持60 s，将压好的片固定于检测室中，PESP100红外光谱仪设置参数如下：开始：4000 cm-1,结束：400 cm-1，扫描： T%，扫描次数：16，选定“T%”为测定指标，点击“基底”扫描空白样品作为背景。再取2 mg样品与198 mg溴化钾一起置于研钵中研磨，然后压片、固定，扫描得到样品光谱图，重复3次。

1.2.3.3 流变特性分析 参考Wang等[12]的方法略有修改。用60 ℃热水配制1.0%和2.0%多糖溶液，用磁力搅拌30 min后，置于4 ℃下过夜，使样品充分水合溶解。选择流变仪的流动扫描模式，测定剪切速率范围为0.1～100 s-1，温度为25 ℃，测定表观粘度，绘制流变曲线；再选择流变仪的振荡幅度模式，使振荡频率恒定在1 Hz，在25 ℃下对应变进行扫描（0.01%～10%），复合模量稳定的应变区则为线性黏弹区；在线性黏弹区内选定一恒定应变，选择流变仪的振荡频率模式，在25 ℃下对振荡频率进行扫描（0.1～10 Hz），测定储能模量（G'）和损耗模量（G''），重复3次。

1.2.3.4 多糖分子量测定 参照Wang等[12]的方法略有修改，利用高效体积排阻色谱法测定，配制2 mg/mL的多糖溶液，过0.22 μm水相膜，分析前超声排气30 min。取20 μL溶液注入SEC系统进行分析。色谱条件：色谱柱：Agilent PL aquageL-OH MIXED-M 8μm；检测器：Agilent G7801A示差折光检测器；流动相：NaNO3溶液；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测器温度：30 ℃；流动泵：Agilent G1311B四元泵；最大压力值：130 Bar。标准品为Mw为135.35、64.65、368、13.05、9.75、5.25和2.7 kDa的葡聚糖，浓度为2 mg/mL。

1.2.4 抗氧化活性测定

1.2.4.1 ABTS+·清除能力测定 参照Li等[13]的方法略有修改。将5 mL 7 mmol/L ABTS溶液与5 mL 2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，在室温下避光反应16 h，作为ABTS贮液。测定前，用蒸馏水稀释贮液，使其在波长734 nm处的吸光度值为0.70±0.02，作为工作液。然后向3 mL工作液中加入0.4 mL不同浓度的样品，剧烈摇晃30 s，避光静置6 min后，在相同波长处测定吸光度值。重复3次。ABTS·+清除率按照下式计算：

式中，A0为对照的吸光度值，A1为样品的吸光度值。

1.2.4.2 FRAP测定 参照Liu等[14]的方法略有修改。将10 mmol/L TPTZ的盐酸溶液（盐酸摩尔浓度为40 mmol/L）、20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液和0.3 mol/L的乙酸钠缓冲溶液（pH3.6）按照1:1:10（v/v/v）混合得到FRAP溶液，并且于37 ℃水浴中温浴保存，此溶液现配现用。在120 μL不同浓度的样品溶液中加入360 μL蒸馏水和3.6 mL FRAP溶液。混匀后于37 ℃水浴保温60 min，取出，于波长593 nm处测定吸光度值，以每毫升不同浓度样品的铁离子还原能力以反应液中FeSO4的摩尔质量表示，重复3次。

1.3 数据处理

使用Excel 2016和Origin 9.0对所有数据进行统计，计算平均值和标准误差并制图；用SPSS Statistics 21.0对所有数据进行方差分析，并进行Duncans’差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 多糖组成分析

2.1.1 脱除蛋白对黄花菜多糖组分的影响 多糖常与蛋白共存或形成糖蛋白复合物。Sevag法可利用有机溶剂使溶液中的蛋白质变性而分离清除蛋白质[11]。结果表明，黄花菜粗多糖得率、蛋白质、多糖、半乳糖醛酸含量分别为2.82%、6.17%、17.93%、17.21%，见图1。脱除蛋白后多糖得率、蛋白质、多糖、半乳糖醛酸含量分别为0.72%、2.55%、34.91%、26.42%。脱除蛋白可以提高多糖的纯度，多糖含量和半乳糖醛酸含量分别提高了16.98%和9.21%。DM为被甲酯化羧基数目占全部羧基数目的百分比，黄花菜多糖DM值为96.13%±0.3%，属高酯果胶，适合用作增稠剂和胶凝剂，可用来改善产品口感。

图 1 脱除蛋白对黄花菜多糖的得率（A）、蛋白质（B）、多糖（C）、GalUA（D）含量的影响Fig.1 Effect of the protein removal on the content of the daylily polysaccharide yield (A), protein (B),polysaccharide (C) and GalUA (D)

2.1.2 单糖组成分析 分析黄花菜多糖中的单糖组成，将不同保留时间对应的峰值与标准品进行比较，进而确定单糖种类及相对含量。通过与标准品对照得知，黄花菜多糖中半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖含量较高，其他种类糖的含量较低（图2）。黄花菜多糖的单糖组成摩尔比结果见表1。黄花菜多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中半乳糖为主要成分。黄花菜多糖中半乳糖、葡萄糖、木糖摩尔比为62.50:17.31:11.30。这与周纪东等[6]发现的黄花菜粗多糖是一种具有吡喃糖环结构的水溶性杂多糖，且可能是一种与蛋白质或多肽以共价键结合的糖复合物类似。

表1 黄花菜多糖中单糖组成Table 1 Monosaccharide composition of daylily polysaccharides

图 2 高效阴离子交换色谱图Fig.2 High performance anion exchange chromatography

2.2 多糖的微观结构与表征分析

2.2.1 扫描电镜微观结构 SEM图像提供了黄花菜多糖的表面形貌特征[15]。SEM结果表明，黄花菜多糖有疏松片状结构，相互交叉连接[16]（图3A）。放大200倍观察发现多糖极易破裂形成小孔，可能是多糖分子间存在相互排斥力，分子间吸引力较弱，导致片状结构断裂（图3B）。放大2000倍后看到部分丝状物质相互缠绕成非均匀的网状结构，还有少量颗粒物质附着杆状物质表面，使多糖呈现蓬松质轻的表观形态，分子的规整性不强，多糖结构中存在较多支链，且结构中存在较强的分子间相互作用力[17]（图3C）。4000倍条件下，可看到表面不平整，有凹陷存在，孔径四周厚度不均一，呈不规则的形状（图3D）。王帅等[18]研究表明多数多糖表面具有孔状的疏松片状结构。Zhu等[19]研究发现，在高倍放大倍数下，多糖表面呈现不均匀的鳞片结构和少量的凹陷。

2.2.2 FTIR分析 傅里叶变换红外吸收光谱谱图是化合物分子的“指纹图”，可以了解化合物的结构信息。黄花菜多糖的FTIR光谱图（图4）显示其具有多糖的一般结构特征[20]。在3412、2912、1368 cm-1这三个波段的吸收峰，即为糖类化合物的特征吸收峰[21]。最宽的吸收发生在3226～3417 cm-1，它是由O-H的伸缩振动引起的[13,22-23]。2912 cm-1是由CH产生的伸缩振动峰。在1636 cm-1有吸收，这是由酯化C=O伸缩振动引起的[24]，表明多糖中含有较多的酯键，为高酯多糖，这与前文DM值结果一致。1368 cm-1处为C-H弯曲振动吸收峰[20]，1013～1120 cm-1由C-OH、C-O-C和C-C伸缩振动引起，1060 cm-1处的峰证实了吡喃环构象的存在[21]，表明了多糖中存在吡喃环[23]。以上结果表明，脱除蛋白后多糖具备碳水化合物典型吸收峰，且存在吡喃糖环结构[15]。

图 3 扫描电镜观察黄花菜多糖Fig.3 SEM observation of daylily polysaccharide

图 4 黄花菜多糖的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of daylily polysaccharide

2.2.3 流变特性分析 黏度是多糖最明显的乳化特征之一[24]。在剪切速率0.1～10 s-1范围内，随着剪切速率逐渐增大，2%和1%多糖溶液的黏度均迅速下降，溶液呈剪切减薄状态（图5A）。当剪切速率大于10 s-1时，溶液的黏度逐渐趋于稳定。黄花菜多糖溶液显示出典型的“假塑性流体”行为，这是由于剪切力使溶液内部卷曲连接的分子结构被拉直，缠结点减少，从而表现为黏度下降[24]。为了进一步探究黄花菜多糖溶液的粘弹性，在恒定频率1 Hz条件下进行应变扫描，以确定线性粘弹区。2%和1%浓度的黄花菜多糖溶液 G*值变化都比较明显图5B），最终确定将黄花菜多糖在应变为0.1%的条件下进行动态振荡实验。

图 5 黄花菜多糖的流变曲线（A）、应变扫描曲线（B）、频率扫描曲线（C）Fig.5 Rheological curve (A), strain sweep curve (B), frequency sweep curve (C) of daylily polysaccharide

储能模量G'指粘弹性材料在交变应力作用下一个周期内储存能量的能力，通常指弹性；耗能模量G''指在一个变化周期内所消耗能量的能力，通常指粘性[25]。黄花菜多糖溶液浓度为1.0%和2.0%时的储能模量（G'）随着振荡频率的增大均增大，在振荡频率为1 Hz之前浓度为1.0%和2.0%时损耗模量（G''）均有小幅度的波动变化，随后随着振荡频率的增大均增大（图5C）。在各浓度下，其G'均大于G''[25-26]，表明在0.1～10 Hz整个频率范围内，多糖溶液表现出弹性行为，呈现凝胶性质[25]。

2.2.4 分子量分布 黄花菜多糖的分子量分布较宽，有两个峰（图6）。表2详细列出了多糖组分的分子量分布情况，组分的分子量较大，重均分子量（Mw）更适合表征它们的分子量[27]。黄花菜多糖峰 1分子量较高，Mw为1310.32 kDa，黄花菜多糖半乳聚糖、阿拉伯聚糖等中性糖侧链含量最为丰富，较高的分支化程度使得其拥有较高的Mw[28]；分散性也很大，PD为2.24。黄花菜多糖峰 2分子量相对小很多，Mw为83.81 kDa。多糖来源和制备方法的不同会导致单糖组成和分子量的较大差异，从而影响其生物功能活性[29]。同一来源的多糖由于其分子量的不同，往往具有不同的功能活性，较高分子量的多糖具有更为复杂的结构，其表现出的生物活性也更为广泛，分子量过低，难以形成具有活性的聚合结构[30]。

表2 黄花菜多糖的分子量分布情况Table 2 Molecular weight distribution of daylily polysaccharide

图 6 黄花菜多糖的HPSEC色谱图Fig.6 HPSEC chromatogram of daylily polysaccharide

2.3 多糖的抗氧化活性

随着黄花菜多糖溶液浓度的增加ABTS+·清除能力整体呈逐渐增加的趋势，在5 mg/mL时ABTS+·清除能力达到78.99%（图7A）。FRAP法可作为样品中的总抗氧化能力的指标[31]。黄花菜多糖的FRAP能力在低浓度时随浓度增大变化幅度较小，当浓度大于0.1 mg/mL，黄花菜多糖的FRAP能力随浓度增大而增大，在5 mg/mL时FRAP值达732.75 mmol FeSO4/mL。可见，黄花菜多糖的铁离子还原能力与浓度成正相关（图7B），表明黄花菜多糖具有较好的抗氧化能力，这可能与多糖的单糖组成相关[18]。此外，有研究报道，分子量也是影响多糖抗氧化性的一方面因素[32]，分子量高的多糖，生物活性往往较高[18]。多糖的活性还与糖苷键、空间构象等有密切关系，但需要进一步的研究[32]。

图 7 黄花菜多糖的ABTS+·清除能力（A）、FRAP能力（B）Fig.7 Daylily polysaccharide ABTS+· scavenging ability (A),FRAP ability (B)

3 结论

探讨了脱除蛋白后黄花菜多糖的结构特性和抗氧化活性，探索了多糖在食品工业中的潜在应用。结果表明，黄花菜中提取多糖得率为0.72%，纯度为34.91%。扫描电镜观察到黄花菜多糖呈絮状结构，互相连接。黄花菜多糖含有高甲酯程度，为大分子量多糖；黄花菜多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中半乳糖为主要成分。FTIR分析表明多糖含有明显的酯键，且存在吡喃糖环结构。黄花菜多糖溶液显示出典型的“假塑性流体”行为，具有凝胶性质。体外抗氧化活性表明，黄花菜多糖对ABTS+·的清除效果和FRAP能力较明显。该研究表明，黄花菜多糖是一种潜在的天然抗氧化剂和胶凝剂，在营养健康产业具有一定的开发应用前景。