饲喂干酪乳杆菌K17对加州鲈鱼肌肉滋味的影响

王劲松，张昌桌，陈 燕，朱卓英，付惠玉，陈兰明,

（1.荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门 448000；2.荆门市公共检验检测中心，湖北荆门 448000；3.荆门市农业综合执法支队，湖北荆门 448000；4.上海海洋大学食品学院，上海 201499）

随着加州鲈鱼养殖密度的增加，其肌肉品质随之下降[1]。在加州鲈鱼小分子滋味成分中，氨基酸、核苷酸等[2]是最主要的成分，各种滋味物质之间相互影响，共同形成了加州鲈鱼的独特滋味。为适应消费者和市场需求，改善养殖加州鲈鱼肉质滋味，提高肌肉游离氨基酸、核苷酸含量，进一步改善加州鲈鱼的营养品质具有重要意义[3]。

养殖的加州鲈鱼肌肉的品质受饲料种类和摄入量的影响，肌肉品质主要由饲料的质量决定[4]。研究表明，改变饲料中蛋白源、脂肪源等营养成分或添加饲料添加剂对鱼肌肉质构和肌肉中游离氨基酸、核苷酸、胶原蛋白等营养成分有一定的改善作用[5-8]。近年来，乳杆菌、芽孢杆菌等益生菌作为饲料添加剂在加州鲈鱼养殖中备受关注，但其有关研究大多集中在提高鱼类免疫力[9-12]、促进生长[9-12]以及对鱼虾类肌肉中基本营养素含量的调节[5-8]等方面。在饲料中添加芽孢杆菌、酪酸梭菌（Clostridium butyricum）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等益生菌对动物肌肉的咀嚼性、持水性和硬度等质构特性和营养成分（如脂肪酸含量组成）等方面有改善作用[13-14]，例如，曹洪忠等报道，通过饲料中添加β-葡聚糖和枯草芽孢杆菌喂养彭泽鲫70 d，明显改善了它肉质的硬度、弹性、粘聚性、无胶性、咀嚼性和恢复力[15]。杨刚等也报道饲料中添加109CFU/kg的枯草芽孢杆菌喂养鲫鱼70 d，显著改善了鲫鱼的抗氧化能力，提升了肉质的硬度、无胶性、咀嚼性和恢复力[15]。同时夏雨等研究证明饲料中添加3株植物乳杆菌和3株副干酪乳杆菌饲养凡纳滨对虾幼虾28 d，3株植物乳杆菌显著地改善了肌肉弹性和咀嚼性，3株副干酪乳杆菌能显著改善肌肉的脂肪酸组成[5]。

饲料中添加抗氧化剂羟脯氨酸改善了大黄鱼的肉质，提高了大黄鱼的抗氧化酶活性，进而促进了胶原蛋白的合成，并且其肉质的硬度、弹性和咀嚼性与肌肉中总胶原蛋白有显著正相关性[16]。Kalavathy等[17]研究发现，鸡饲料中添加4种不同乳杆菌混合物能增加不饱和脂肪酸含量，减少胆固醇水平。肉质中增加的不饱和脂肪酸可能是因为饲料中添加的抗氧化剂保护的效果，因为这些抗氧化剂作为电子供体，为某些不饱和脂肪酸的还原提供了电子[18]。可见饲料中添加抗氧化剂可以改善肉质的质构和滋味。实验室前期从传统发酵食品朝鲜泡菜中筛选出一种体外抗氧化性较强的干酪乳杆菌K17[19]，将不同剂型干酪乳杆菌K17添加到加州鲈鱼饲料中，发现干酪乳杆菌K17能增强加州鲈鱼体内抗氧化性，调节加州鲈鱼肠道菌群结构和代谢功能[20]，并能促进加州鲈鱼快速生长且改善其肝脏健康和肉质[21]。目前还未有报道干酪乳杆菌对鱼类滋味物质影响的研究。本实验将具有较强抗氧化性的干酪乳杆菌K17添加到加州鲈鱼饲料中喂养69 d后，分析其对加州鲈鱼肌肉中呈味氨基酸及呈味核苷酸之间的影响，对它们的组成及含量进行分析，并计算其味道强度值（Taste active values, TAV）和味精当量（Equivalent umami concentrations, EUC），同时借助电子舌，探究饲喂干酪乳杆菌K17对滋味物质的影响，为益生菌在加州鲈鱼养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

加州鲈鱼（100日龄） 湖州市胖子淡水鱼繁殖基地；干酪乳杆菌K17 实验室保存；饲料，浙江东裕生物科技有限公司；三氯乙酸、高氯酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、三氯叔丁醇、NaOH、KOH 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；肌苷酸（Inosinic acid，IMP）、腺苷酸（Adenosine monophosphate，AMP）和鸟苷酸（Guanylic acid，GMP）标注溶液（三者纯度均不小于99%）、氨基酸混合标准溶液美国Sigma-Aldrich公司。

SB25-12DT超声清洗仪 宁波新艺超声设备有限公司；FJ200-SH数显高速分散均质机 上海标本模型厂；PL2002梅特勒-托利多精密天平 METTLER TOLEDO，Zurich，瑞士；5424高速冷冻离心机Eppendorf，Hamburg，德国；L-8800氨基酸全自动分析仪 日本Hitachi公司；W2690/5高效液相色谱仪

美国Waters公司；ASTREE电子舌 法国Alpha MOS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验饲料制备 在本研究中，商业饲料被用作饲喂加州鲈鱼的基础饲料。根据先前描述的方法制备了六种实验饲料（表1）[22]。从实验室冻存管中接种干酪乳杆菌K17到5 mL无菌MRS培养基中，在37 ℃下厌氧培养18 h至对数生长中期，随后，在4 ℃条件下3000×g离心10 min收集其细胞，用无菌氯化钠（0.85%）将细胞沉淀洗涤两次，并将其稀释至

表1 本研究中饲喂加州鲈鱼的六种试验饲料Table 1 Six experimental diets for feeding M.salmoides in this study

1×109CFU/mL（使用菌落计数法测定）[23]。同时，将上清液用0.22 μm孔径过滤器除去残留的细菌细胞，得到的上清液用作FS组添加物。将1×109CFU/mL活细胞菌液在65 ℃下加热30 min，得到热灭活的干酪乳杆菌K17细胞，用作DB组添加物。然后将

1×109CFU/mL活细胞菌液添加10%脱脂奶粉[24]，作为MB添加物。将得到的30 mL干酪乳杆菌K17菌液在超净工作台中的无菌矩形托盘中分别均匀地喷涂到300 g基础饲料中，用无菌采样袋封装后在4 ℃下储存，并在7 d内使用完。每周使用菌落计数法检查制备的饲料中的干酪乳杆菌K17浓度[23]。FS、MG和SG饲料制备方法与上述相同。

1.2.2 加州鲈鱼的培养条件 参照Wang等[20]方法饲喂加州鲈鱼。将购买的800条加州鲈鱼在中国上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心的三个室内水泥池（5.0 m×3.0 m×1.8 m）中暂养两周，期间采用商业饲料进行饲养。随后，将挑选出来大小均一的450尾加州鲈鱼（平均（33.0±0.5）g）随机分配至18个网箱，网箱大小为1.5 m×1.0 m×1.8 m，每个网箱分配25条。试验设计了六个处理组（表1），每个处理组均进行了三次重复（笼）试验。饲养期间，每天投喂2次（上午06:00～07:30和下午17:00～18:30），饲养试验进行了69 d。每日饲喂量约为加州鲈鱼平均体重的4%，并每周进行调整以确保鱼在饲喂后1 h内吃完分配的饲料，每天记录所消耗的饲料量。

1.2.3 样品采集 在喂养实验完成后，所有处理组的加州鲈鱼被禁食12 h，记录每个网箱中鱼的数量及总重量。从每个网箱中随机挑选3条中等大小的鱼，用丁香酚麻醉至鱼微微侧翻。收集鱼背侧左边的鱼片样本，分析其游离氨基酸和呈味核苷酸含量。

1.2.4 电子舌分析 参考周纷等[25]的方法测定电子舌数据。称取剁碎的鲈鱼背肉（2.00 g）于离心管中，加入25 mL去离子水在均质机中均质2 min以提取水溶性成分，室温静置15 min，4 ℃下以10000 r/min离心（10 min），过滤取上清液定容至100 mL。此后，吸取5 mL该溶液稀释40倍，然后用于电子舌分析。在分析样品之前，对电子舌的传感器进行调节（0.01 mol/L盐酸），校准（0.01 mol/L盐酸）。在成功校准后，对每个时间点背肉样品进行7次分析，主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）是取后3次的数据。

1.2.5 游离氨基酸测定 参考付娜等[26]方法测定游离氨基酸。称取样品2.0 g，加入质量分数为15%的三氯乙酸溶液15 mL，匀浆2 min后，静置2 h，以10000 r/min离心（15 min），过滤后取5 mL上清液，调节（3 mol/L的NaOH溶液）pH至2.0，定容至10 mL，摇匀，过0.22 μm膜，滤液上机检测。操作均在4℃条件下进行。氨基酸自动分析仪条件：色谱柱（4.6 mm×150 mm，7μm）；柱温 50 ℃；1 通道流速：0. 4 mL/min，2通道流速：0. 35 mL/min。流动相：柠檬酸钠和柠檬酸的混合缓冲液（pH为3.2、3.3、4.0、4.9）以及茚三酮缓冲液（质量分数为 4%）。

1.2.6 呈味核苷酸测定 参考Chen等[27]方法测定核苷酸。称取样品5.0 g置于50 mL离心管中，加入10 mL质量分数为10%的HClO4，均质（2 min），以10000 r/min离心（15 min），过滤后取上清液。用5 mL质量分数为5%的HClO4洗涤沉淀，再次离心，合并上清液。调节上清液pH（pH=6.5），静置（30 min）迅速定容至50 mL，摇匀，过0.45 μm膜待测。操作均在4 ℃条件下进行。高效液相色谱条件：ODS-SP C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），ODS-SP保护柱柱芯（4 mm×10 mm，5 μm）；流动相A为pH是6.5的0.05 mol/LKH2PO4和K2HPO4（1:1）溶液，流动相B为甲醇溶液，等梯度洗脱（流速1 mL/min）；柱温28 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。

1.2.7 味道强度值（TAV）和味精当量（EUC） 滋味物质的TAV是滋味物质的绝对浓度值除以它的味道阈值，计算公式如下：TAV=C/T。式中，TAV：味道强度值；C：滋味物质的绝对浓度值，mg/100 g；T：滋味物质的味道阈值，mg/100 g。参照Chen等[27]的方法计算EUC，通过计算鲜味氨基酸和呈味核苷酸的质量分数获得。计算公式如下：EUC =Σaibi+1218（Σaibi）（Σajbj）。式中：EUC按样品所含谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）质量分数计，%；ai为鲜味氨基酸（Asp、Glu）质量分数，%；bi为鲜味氨基酸相对于MSG的相对鲜度系数（Glu为1，Asp为0.077）；aj为呈味核苷酸（IMP、AMP）质量分数，%；bj呈味核苷酸相对于IMP的相对鲜度系数（IMP为1，AMP为0.18）；1218为协同作用系数。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0版软件进行统计分析，使用单因素方差分析和Duncan新复极差法分析显著性，结果以平均值±标准误差表示，P＜0.05[28]。

2 结果与分析

2.1 电子舌分析

由图1可知，利用电子舌传感器响应值数据建立二维图，进行主成分分析，PC1为63.411%，PC2为32.204%，累计为95.615%，说明PC1和PC2能够反映样品的整体信息。从图1可看出，各处理组与对照组SG分布区域无重叠，说明处理组与对照组的味觉均有一定差异。6组样品中FS组和MB组样品分布区域有点重叠，说明两者在味觉特征上较为相似，不能完全区分，而且两者与对照组分布区域相隔最远，说明两者与对照组差异最明显；DB组、MG组、LB组样品分布区域较为接近，但未重叠，在一定程度下可以区分，说明三组之间味觉有一定差异。提取电子舌各传感器响应值数据进行判别因子分析（Discriminant factor analysis，DFA）。DFA分析是在PCA基础上，对滋味的响应信号数据优化处理，更好地将不同副产物区分开，分析结果由图2所示。六边形的6个点为该组重复样品，第一主成分和第二主成分的累计贡献率达到90.651%，因此可以较全面地代表样品原有信息。另外， LB组和MG组样品与对照组SG组所在区域有所重叠，不易区分，说明LB组和MG组与对照组SG滋味差异较小；MB组、DB组、FS组样品所在区域无重叠，易区分；FS组和MB组分布区域相近，但与对照组SG相距较远，说明FS组和MB组滋味接近且与对照组SG滋味差异最为明显，可能滋味物质的形成与饲料中添加的活菌数和菌落代谢物相关。

通过电子舌各个传感器的响应值，建立不同样品的滋味雷达图（图3）。从图3中可知，6组样品在苦味（BRS）、复合味1（GPS）、复合味2（SPS）、鲜味（UMS）的差异较明显；酸味（SRS）上几乎无差异，各滋味相对大小排列如下：鲜味（UMS）：MB＞DB＞FS＞LB＞MG＞SG；甜味（SWS）：MG＞LB＞DB＞FS＞MB＞SG；苦味（BRS）：FS＞MG＞MB＞LB＞DB＞SG，SG组在除复合味2（SPS）外的其余6项味觉特征响应值都为最低，这与PCA分析结果类似，说明饲料中添加不同形式干酪乳杆菌K17，对加州鲈鱼滋味有一定影响。

图 1 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料的加州鲈鱼肌肉电子舌PCA分析图Fig.1 PCA analysis of electronic tongue of muscle of M. salmoides fed with 6 groups of different Lactobacillus casei K17 feeds

图 2 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料的加州鲈鱼肌肉电子舌DFA分析图Fig.2 DFA analysis of electronic tongue of muscle of M. salmoides fed with 6 groups of different Lactobacillus casei K17 feeds

图 3 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料的加州鲈鱼肌肉滋味雷达图Fig.3 Taste radar map of electronic tongue of muscle of M.salmoides fed with 6 groups of different Lactobacillus casei K17 feeds

2.2 游离氨基酸含量测定

氨基酸可以增强食品的滋味特性，也可以间接参与滋味的形成[29-30]。不同的游离氨基酸之间以及氨基酸与IMP等其他成分之间存在相互协同作用[31]。由表2得知，6组加州鲈鱼肌肉中检测出16种游离氨基酸，Ala在各组均未检出，各组游离氨基酸总量差异不显著。从鲜味氨基酸水平来看，MB组鲜味氨基酸总量和Asp含量显著高于SG组（P＜0.05），鲜味氨基酸总量的大小顺序为：MB＞DB＞FS＞LB＞MG＞SG，与电子舌预测的鲜味顺序一致。从甜味氨基酸来看，Thr、Ser、Pro、Gly和SFA处理组和对照组差异不显著。从苦味氨基酸来看，FS组Val、Ile、Leu、Phe和BRS含量显著高于对照组SG（P＜0.05），苦味氨基酸总量的大小顺序为：FS＞MG＞MB＞DB＞LB＞SG，与电子舌预测的苦味顺序基本一致。

表2 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料对加州鲈鱼肌肉游离氨基酸的影响Table 2 Effects of six different groups of Lactobacillus casei K17 feeds on free amino acids in muscle of M. salmoides

当TAV值大于1时，该物质TAV值与样品的呈味成正比[32]。根据表3，只有Gly与His的TAV值大于1，各组Gly的TAV值都在3以上，各组的His的TAV值都在6以上。Gly为甜味氨基酸，对鱼虾等水产品的鲜味有重要贡献[33-34]。Gly不仅能提供清香甜味，还能减少苦味，并能从食物中除去令人不快的口味[35]。含杂环基团的His被认为是肉香味形成的关键物质[36]。可见，从TAV来看，His和Gly是影响加州鲈鱼肌肉滋味的重要氨基酸。

表3 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料对加州鲈鱼肌肉游离氨基酸TAV的影响Table 3 Effects on TAV of free amino acids in muscle of M. salmoides in the six groups

由图4得知，与对照组相比，各组的必需氨基酸总量与游离氨基酸总量都得到了提升，MG组的必需氨基酸总量为2.33 mg/100 g，增加量最大，且与SG组差异显著（P＜0.05），可能是MG组饲料中添加的脱脂奶粉含有丰富的蛋白质，其在鲈鱼体内被充分吸收后转化成必需氨基酸。各处理组游离氨基酸总量虽有一定提升，但是与对照组无显著差异，这与王四新等[37]对于北京黑猪饲喂干酪乳杆菌所测得游离氨基酸总量结果与对照组存在显著（P＜0.05）差异不同，这可能是鱼类与畜类的肠道菌群结构不同，益生菌对两种不同的动物作用效果存在差异，此外，也有可能是益生菌种类不同，饲养环境存在差异的结果，有待于进一步研究。

图 4 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料对加州鲈鱼肌肉游离氨基酸总量和必需氨基酸总量的影响Fig.4 Effects on essential amino acid and free amino acids and in muscle of M. salmoides in the six groups

2.3 呈味核苷酸、TAV和EUC值测定

核苷酸及其关联化合物是影响水产品滋味的另一类重要成分，其中，GMP、IMP和AMP是典型的呈鲜味的核苷酸[38]，效果优于MSG，并且它们在呈鲜味方面存在协同效应[7]。呈味核苷酸含量见表4。由表3可知，MB组的IMP和GMP值与SG组相比均有显著增加（P＜0.05），各组IMP的TAV值大小顺序为MB＞DB＞MG＞LB＞FS＞SG，GMP的TAV值大小顺序为MB＞DB＞LB＞MG＞FS＞sSG，且均大于1，说明各组的IMP和GMP对鲈鱼肌肉鲜味有显著贡献，且MB组的鲜味最大，与对照组相比差异明显。因为脱脂奶粉对干酪乳杆菌K17的保护，使其在鲈鱼肠道中存活率最高，产生了一系列的小分子代谢物（包括IMP和GMP），这部分物质进一步被肌肉组织吸收，增加了鲈鱼肌肉的鲜味。MB组AMP含量在100 mg/g以上时，鲜味逐渐增强，甜味逐渐减弱[39]。各组AMP含量均大于100 mg/g，AMP的TAV值均大于1，且FS＞DB＞MB＞MG＞LB＞SG，说明各组AMP对鲜味特征贡献较大而对甜味特征贡献较弱，且FS组的AMP最大，但各组之间差异不显著。呈味氨基酸与呈味核苷酸同时存在能显著提高食品的鲜味，即产生协同效应。因此为了更加全面地评价加州鲈鱼的鲜味，可采用EUC值来评价鲜味强度[32]。本研究根据6个处理组加州鲈鱼肌肉鲜味氨基酸和呈味核苷酸的数值计算出各组的EUC值，如表4所示。MB组的EUC值最大，与对照组相比差异显著，6组EUC呈现为MB＞DB＞FS＞LB＞MG＞SG，与电子舌测定大小值一致，可见EUC是量化鱼肌肉鲜度的推荐指标。其中味精呈味阈值为0.03%，MB中EUC为2.93%相当于100 g碎肉和头肉中所具有的鲜味强度相当于2.93 g味精产生的鲜味，其值远高于味精的阈值。结合EUC来看，MB组的EUC增加最明显，且与对照组相比差异显著（P＜0.05），其原因可能是添加脱脂奶粉保护剂的干酪乳杆菌，在饲料和进入加州鲈鱼肠道中活菌数更高，该活菌在鱼肠道中能调节肠道中营养物质代谢，进而在鱼体内产生部分鲜味物质，这与在北京黑猪饲料中添加干酪乳杆菌后其鲜味氨基酸总量显著高于未加干酪乳杆菌组的结果一致[37]。综合TAV值与EUC值，MB组的鲜味增强最为明显。

表4 饲喂6组不同干酪乳杆菌K17饲料对加州鲈鱼肌肉呈味核苷酸、TAV和EUC值的影响Table 4 Effects on taste nucleotides, TAV and EUC in muscle of M. salmoides in the six groups

3 结论

6组加州鲈鱼肌肉中检测出16种游离氨基酸，MB组鲜味氨基酸总量、Asp含量和EUC显著高于SG组（P＜0.05），6组的鲜味氨基酸总量、苦味氨基酸总量和EUC的大小顺序均与电子舌预测的顺序基本一致。因此饲喂干酪乳杆菌K17不同剂型对加州鲈鱼滋味成分和含量的影响存在明显差异， MB组饲料对加州鲈鱼肌肉整体滋味贡献最大，这可为干酪乳杆菌K17在加州鲈鱼养殖中应用提供参考。另外，本文虽对饲喂干酪乳杆菌K17不同剂型对加州鲈鱼滋味成分和含量进行了测定和分析，但是导致这些差异的具体原因需要进一步的实验验证。