基于核壳型亲水作用色谱技术同时测定冬虫夏草中核苷和糖醇类成分的含量

钱正明，周妙霞，方琼谜，温宝庆，李文佳，吕根品，李文庆*

(1. 暨南大学药学院，广州 510632；2. 乳源东阳光药业有限公司，广东韶关 512721；3. 东莞市东阳光冬虫夏草研发有限公司，广东东莞 523850)

冬虫夏草Ophiocordycepssinensis是指由冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾科昆虫幼虫而形成的幼虫尸体与真菌子座复合体(邱雪红等, 2016; 韩日畴等, 2019)，最早出现于《月王药诊》，性味甘平，归肺、肾经，具有补肾益肺、止血化痰的功效(李皓翔等, 2020)。冬虫夏草中含有多种化学成分，包括核苷、糖醇、甾醇等(钱正明等, 2016)。冬虫夏草中主要的核苷类成分为尿苷、腺苷、肌苷和鸟苷，具有提高免疫力、促进血液循环等功效(艾中等, 2016)。冬虫夏草中主要的糖醇类成分为甘露醇，又称虫草酸，有利尿、镇咳、祛痰等作用(王泽凤等, 2013)。核苷和糖醇类成分作为冬虫夏草中两类重要的活性物质，常被作为冬虫夏草质量的评价指标(钱正明等, 2014; 张萍等, 2016; 李文庆等, 2018)。

冬虫夏草核苷类成分的分析方法主要是高效液相色谱法，且以反相色谱法的使用最为广泛(艾中等, 2016)。为了增加核苷类成分的保留，获得理想的分离效果，通常需要选用能够耐受纯水的特殊色谱柱，使用高比例的水相，甚至是100%水相进行分析(商国举等, 2015; 昝珂等, 2017; 2018)。糖醇类化合物比核苷类成分的极性更强，在反相色谱柱上基本没有保留，常用的分析方法包括高效阴离子交换色谱或亲水作用色谱。亲水作用色谱是以亲水固定相及含有60%以上非质子有机溶剂(通常为乙腈)的水为流动相的色谱模式(郭志谋等, 2009; 李瑞萍等, 2014; Marrubinietal., 2018)。前期有研究者运用亲水作用色谱技术同时分析虫草类样本中核苷及糖醇成分，但洗脱时间为60 min，平衡色谱柱为35 min，总耗时长达95 min(Wangetal., 2009)。

核壳型填料也称为表面多孔型填料，填料的结构为实心内核和多孔壳外层(Alietal., 2012; Gumustasetal., 2019)，既能保持小粒径填料高效快速分离的优势，又能降低背压，在快速分析中表现出优越的分离性能(夏红军等, 2020)。随着核壳型色谱柱的固定相类型日益丰富，核壳型亲水作用色谱在极性化合物分析的应用也日益增多(Zhangetal., 2019; Aresetal., 2020)。

本研究采用核壳型亲水作用色谱，实现了冬虫夏草中核苷和糖醇类活性成分的快速同时分析，将有助于提升冬虫夏草产业化质量评价和质控水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品

冬虫夏草样品收集自湖北省、四川省、青海省和西藏自治区，经鉴定为冬虫夏草(表1)。

1.1.2主要仪器

高效液相色谱仪(1260Ⅱ型，美国安捷伦科技有限公司)；蒸发光散射检测器(1260Ⅱ型，美国安捷伦科技有限公司)；十万分之一电子分析天平(XS 205型，美国梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温水浴锅(HH-S28型，常州天宏实验仪器厂)；超纯水制备系统(Milli-Q，德国默克密理博公司)。

1.1.3主要试剂

甲醇(分析纯)(西陇科学股份有限公司)；乙腈(色谱纯)(美国斯百全公司)；乙酸铵、乙酸(色谱纯)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；尿苷(99.7%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；腺苷(99.4%)(武汉远成化工有限公司)；肌苷(98.6%)(中国食品药品检定研究院)；鸟苷(99.0%)(美国赛默飞世尔科技公司)；甘露醇(99.1%)(中国食品药品检定研究院)。

1.2 方法

1.2.1对照品储备液的制备

准确称取甘露醇、尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷对照品，用90%甲醇溶解，配制得4.75 mg/mL的甘露醇对照品储备液；含尿苷、腺苷、肌苷和鸟苷分别为96.76、102.03、97.71和86.57 μg/mL的核苷混合对照品储备液。

1.2.2供试品溶液的制备

称取冬虫夏草粉末(过三号筛)0.2 g，加入90%甲醇10 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，过滤即得。

1.2.3色谱条件

色谱柱为Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC(4.6 mm×50 mm×2.7 μm)；流动相A为5 mmol/L乙酸铵溶液(pH5.5)；流动相B为100 mmol/L乙酸铵溶液(pH5.5)-乙腈(5 ∶ 95)；洗脱梯度为0～6 min，100% B；6～8 min，100%～95% B；流速为1.2 mL/min；柱温为25℃；进样量为2 μL(S15和S16样本核苷测定为正常进样，甘露醇测定为稀释一倍后进样)；紫外检测波长260 nm。蒸发光散射检测器：蒸发温度为45℃；雾化温度为45℃；气体流量为1.80 L/min。

1.2.4计算方法

用紫外检测器测定核苷类成分，由峰面积与质量浓度之间的线性方程计算核苷类成分的质量浓度；用蒸发光散射检测器测定糖醇类成分，由峰面积和质量浓度分别进行对数转换后所得的线性方程计算糖醇类成分的质量浓度；根据供试品称样量及稀释倍数，进而求得供试品中核苷类成分和糖醇类成分的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1专属性考察

取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各1份，按“1.2.3”项下色谱条件进行分析。结果显示，8 min内待测成分尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇均实现基线分离(分离度大于1.5)，空白溶液在目标峰位置无干扰，供试品与对照品的目标峰保留时间一致，表明方法具有良好的专属性。空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。

2.1.2线性考察

精密量取移取“1.2.1”项下甘露醇对照品储备液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL和核苷混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于10 mL容量瓶中，用90%甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度的甘露醇和核苷混合对照品溶液。按“1.2.3”项下色谱条件分析，用紫外检测器检测核苷类成分，以峰面积对质量浓度作函数，用蒸发光散射检测器检测糖醇类成分，以峰面积对数值对质量浓度的对数值作函数，分别绘制标准曲线并进行线性回归。结果显示，5种成分的线性相关系数均大于0.999，表明5种成分在表2所示的范围具有良好的线性关系(表2)。

2.1.3检测限和定量限考察

取“1.2.1”项下对照品储备液分别用90%甲醇经逐级稀释后，按“1.2.3”项下的色谱条件分析。测得信噪比为3时，对照品稀释液的质量浓度为检测限；测得信噪比为10时，对照品稀释液的浓度为定量限，结果见表2。

2.1.4精密度考察

取混合对照品溶液1份，按“1.2.3”项下的色谱条件分析，同一日内连续进样6针，尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇的峰面积RSD值(n=6)分别为0.7%、0.5%、1.8%、0.7%和1.3%，表明仪器日内精密度良好。连续三日，每日进样2针，尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇的峰面积RSD值(n=6)分别为1.3%、1.1%、1.1%、1.8%和2.3%，表明仪器日间精密度良好。

图1 空白溶液(A)、对照品溶液(B)和样品(C)高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of blank solution(A)、reference substances(B)and sample(C)注：1，尿苷；2：腺苷；3，肌苷；4，鸟苷；5，甘露醇。Note: 1, Uridine; 2, Adenosine; 3, Inosine; 4, Guanosine; 5, Mannitol.

表2 对照品的线性、检测限和定量限考察结果

2.1.5重复性考察

取同一批次的冬虫夏草粉末(S3)6份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下的色谱条件分析。结果显示，样品中尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇的平均含量(n=6)分别为0.042%、0.032%、0.035%、0.013%和10.4%，RSD值分别为1.9%、1.8%、1.9%、3.2%和2.2%，表明方法具有良好的重复性。

2.1.6准确度考察

精密量取已知含量的冬虫夏草粉末(S3)6份，每份0.1 g，置于圆底烧瓶，精密加入混合对照品溶液(含尿苷、腺苷、鸟苷、肌苷和甘露醇)10 mL，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下的色谱条件分析。结果显示，样品中尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇的平均回收率(n=6)分别为99.2%、105.0%、106.1%、99.0%和99.7%，RSD值分别为2.2%、2.5%、1.9%、2.7%和1.2%(表3)。

2.1.7稳定性考察

取冬虫夏草粉末(S3)1份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下的色谱条件分析，分别于0、2、4、8、12、16和24 h进样分析。结果显示，样品中尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇的峰面积RSD值分别为0.8%、1.0%、1.8%、2.1%和2.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2 样品测定

收集不同产地的冬虫夏草样品，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下的色谱条件分析，结果见表4。

表3 准确度考察结果

表4 不同产地冬虫夏草的核苷和糖醇类成分的含量

3 结论与讨论

3.1 色谱条件的优化

本研究首次采用核壳型亲水作用色谱柱，实现了冬虫夏草中核苷和糖醇类成分的快速同时分析。陈克盼等(2015)等采用高效液相色谱法同时测定冬虫夏草中5种核苷；Zongetal.(2015)采用UHPLC-ESI-MS/MS法同时测定冬虫夏草中13种核苷及碱基；李文庆等(2018)采用HPLC-ELSD法同时测定冬虫夏草中3种甾醇的含量。大部分关于冬虫夏草中多种成分的同时分析的报道是针对化学结构相似的同一类化合物，而同时测定两类以上化合物含量的报道相对较少。Wangetal.(2009)使用Grace Prevail Carbohydrate ES色谱柱实现了对冬虫夏草中核苷、糖及糖醇等两类以上成分的分析，但分析时间需60 min。本研究在前人的研究基础上进行了优化。首先选择了对核苷和糖醇等强极性化合物有很好保留和分离选择性的亲水作用色谱柱。为提高检测效率，本研究选择了2.7 μm粒径的核壳柱。该色谱柱的填料由1.7 μm直径的实心内核和0.5 μm厚的多孔层组成，这种结构提供了较短的传质路径，减少了轴向扩散，从而使分析速度更快(岳焕新等, 2016)。在流动相优化方面，研究发现，随流动相中乙腈的比例增加或缓冲盐浓度的增加，核苷和糖醇类成分的保留增强，当初始流动相乙腈比例为95%，乙酸铵浓度为5 mmol/L时，可确保4种核苷和甘露醇的分离效果及峰型最优。通过色谱条件的优化，本研究所建立的分析方法可在8 min内完成冬虫夏草中尿苷、腺苷、肌苷、鸟苷和甘露醇的测定，与已有报道相比，分析速度更快，更适合在产业化生产中应用。

3.2 提取条件的确定

冬虫夏草中核苷类成分的提取溶剂主要有水、甲醇或一定浓度的甲醇水溶液(Lanetal., 2004; 毛新亮等, 2009; 周菊峰等, 2009; 昝珂等, 2018)。钱正明等(2016)研究发现，在室温水超声提取的条件下，冬虫夏草水溶液中存在腺苷酸向腺苷、腺苷向肌苷转化的现象，使用沸水或90%甲醇提取可抑制该转化。而糖醇类成分通常使用水作为提取溶剂(林慧等, 2013; 李文庆等, 2018; 钱正明等, 2019)。为避免核苷酸、核苷之间的转换问题，本研究采用90%甲醇作为提取溶剂。另外比较了90%甲醇和水对甘露醇的提取效果。结果表明，使用90%甲醇和水提取的甘露醇含量分别为10.3%和10.6%，二者基本一致。此外，本研究还对提取时间进行确认，回流提取30 min和60 min的含量一致，说明回流提取30 min已经能确保目标成分提取完全。

3.3 测定结果分析

钱正明等(2015, 2016)测得冬虫夏草中尿苷含量为0.037%～0.065%，腺苷含量为0.021%～0.034%，肌苷含量为0.006%～0.023%，鸟苷含量为0.005%～0.015%。王泽凤等(2013)测定冬虫夏草中甘露醇含量为10.2%～12.3%；李文庆等(2018)测定42批冬虫夏草的甘露醇含量为6.16%～14.14%。本次实验测定了20批冬虫夏草，除个别样本的肌苷和鸟苷低于定量限外，其余样本的尿苷含量为0.021%～0.070%，腺苷含量为0.011%～0.040%，肌苷含量为0.006%～0.053%，鸟苷含量为0.005%～0.025%，甘露醇含量为8.7%～12.3%，该范围与文献报道的结果一致。20批冬虫夏草的腺苷含量均符合2020年版《中国药典》中冬虫夏草质量标准不低于0.010%的要求(国家药典委员会, 2020)。

本研究建立了一种可以快速同时分析冬虫夏草中核苷和糖醇类成分的方法。方法学考察显示，该法具有良好的专属性、线性、灵敏度、精密度、准确度和溶液稳定性，20批不同来源的样品检测结果进一步确认了其实用性。本研究所建立的方法可以快速、准确地同时测定冬虫夏草中两类重要的活性成分，为冬虫夏草产业化质量评价提供了参考。