CD3ζ链引入YRHQ基序可增强靶向HER2的CAR-T细胞的抗肿瘤活性

王田，张征峥，王晓峰，张紫梦，张雨晴，马翠卿，宋淑霞（河北医科大学 免疫学教研室 河北省重大疾病免疫机制及干预重点实验室，河北 石家庄 050017）

近年来，CAR-T 细胞疗法在难治性急性淋巴细胞白血病治疗中取得了令人瞩目的成就[1-3]，然而在实体瘤治疗中仍有诸多挑战[4]。CAR 的胞内信号不仅对进入实体瘤的CAR-T 细胞活化起决定作用，且在一定程度上可决定效应性和记忆性CAR-T细胞的分化，进而影响CAR-T细胞的杀伤活性及持久性[5-6]。适当地修饰CAR 信号分子以平衡CAR-T 细胞在抗原刺激下的激活与分化，是优化CAR 结构的一个重要手段。HER2 是表皮生长因子受体家族的成员之一，在乳腺癌、肺癌等多种实体瘤组织中高表达[7]，而在正常组织中一般不表达或低表达。有研究结果[8]显示，靶向HER2 的CAR-T 细胞可浸润到曲妥珠单抗无法进入的乳腺癌组织中，并有效杀伤肿瘤细胞。YRHQ 氨基酸基序是STAT3 的胞内结合位点[9]，STAT3是JAK/STAT通路中重要的转录因子，参与诱导IFN-γ等多种细胞因子的转录，并具有抑制Treg细胞分化、维持CD8+T细胞效应功能的作用[10]。本研究以本室制备的ScFv 为基础[11]，制备含有CD3ζ 和CD28共刺激信号的H28ξ-CAR-T细胞，同时将CD3ξ链的羧基末端倒数第6 至第9 位氨基酸LHMQ 替换为YRHQ基序，制备了H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞，并对其抗肿瘤活性进行了评估。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒及主要试剂

人胚肾细胞HEK-293T、卵巢癌细胞SKOV3、乳腺癌细胞MDA-MB-453 和MCF-7、慢病毒表达载体质粒pCDH-CMV-GFP和包装质粒pLP-1、pLP-2、pLP-VSVG均为本实验室保存，人T淋巴细胞来自河北省中医院健康体检者。感受态Stellar 细胞购自日本TaKaRa公司。

限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ购自美国NEB公司，DNA 回收试剂盒购自北京生化天根科技有限公司，T4 DNA 连接酶、脂质体2000 均购自美国Thermo 公司，人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物科技有限公司，CD3磁珠、CD28抗体、流式抗体PE Mouse Anti-Human CD3、APC Mouse Anti-Human CD45RO、PE Rat Anti-Human CCR7、Biotin-Protein L及PE Streptavidin均购自美国BD公司，CD3单克隆抗体（OKT3）购自德国Miltenyi Biotec 公司，重组人IL-2、重组人IL-7均购自美国Peprotech公司，LDH 检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，IFN-γ、IL-2 ELISA 检测试剂盒均购自杭州联科生物技术有限公司，颗粒酶B 检测试剂盒购自美国Proteintech公司，兔抗HER2抗体、兔抗PD-1抗体、兔抗TIM-3抗体、兔抗人GAPDH抗体均购自杭州华安生物公司，HRP标记的羊抗兔二抗购自CST公司，荧光二抗购自上海Abacm 公司，H28ξ-CAR 和H28ξ(YRHQ)-CAR全长DNA由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

1.2 慢病毒表达载体pCDH-HER2-CAR的构建

将H28ξ-CAR 或H28ξ（YRHQ）-CAR 全长DNA序列，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，通过常规分子生物学技术分别连接到pCDH-CMV-GFP 载体，获得pCDH-H28ξ-CAR 和pCDH-H28ξ(YRHQ)-CAR 重组表达质粒。

1.3 慢病毒制备与病毒滴度检测

将pCDH-H28ξ-CAR和pCDH-H28ξ(YRHQ)-CAR重组质粒分别与包装质粒pLP-1、pLP-2、pLP-VSVG按1∶1∶1∶1的比例共转染293T 细胞，分别收集48、72 h的细胞培养上清，过滤后经20%蔗糖密度梯度超速离心浓缩，获得携带两种不同HER2-CAR 的慢病毒颗粒，分装后于-80 ℃保存。

将293T 细胞接种于24 孔板（3×105个/孔），培养过夜，分别用1、2、4 μL的两种慢病毒感染，72 h后，经FCM 检测GFP 表达阳性细胞的百分率，选取感染效率为10%～40%的组进行滴度计算，计算公式：慢病毒的滴度（TU/mL）=每孔细胞总数×GFP+细胞百分率×103/加入的病毒体积（μL）。

1.4 HER2-CAR-T细胞的制备及鉴定

淋巴细胞分离液分离健康人外周血PBMC，经抗CD3 免疫磁珠分选CD3+T 细胞，FCM 检测CD3+T细胞纯度。采用含5 μg/mL 的CD3mAb（OKT3）、0.5 μg/mL的CD28mAb、10 ng/mL的IL-2和IL-7的完全培养基活化CD3+T 细胞，48 h 后，加入MOI=50 的慢病毒和8 μg/mL 的病毒感染增强液，1 000×g离心1.5 h，未感染病毒的T 细胞作为阴性对照。离心后，将细胞培养板常规培养12 h或过夜，离心换液后继续培养。根据细胞的生长密度，每48 h 补充1 次IL-2 和IL-7（均补至20 ng/mL），每隔2～3 d 传代扩大培养。制备的细胞分别命名为H28ξ-CAR-T 细胞和H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞。

取感染72 h的T细胞于流式管中，分别加入生物素标记的L-蛋白及PE-Streptavidin，室温避光处理45 min，通过FCM检测T细胞表面CAR的表达率。在感染的第1、3、5及第7天，分别对CAR-T细胞进行计数。

1.5 细胞免疫荧光技术鉴定靶细胞表面HER2 抗原的表达

取培养至对数生长期的SKOV3、MDA-MB-453和MCF-7细胞，置于加入了玻片的24孔细胞培养板，待玻片上的细胞汇合度约80%时，吸出上清液，PBS洗3 次，经4%多聚甲醛固定、山羊血清封闭、兔抗人HER2一抗及抗兔荧光二抗分别处理后，荧光显微镜下观察HER2的表达。

1.6 LDH 释放法检测HER2-CAR-T 细胞体外杀伤效果

取处于对数生长期的SKOV3、MDA-MB-453 和MCF-7细胞，分别置于96孔板中（104个/孔），培养4 h待细胞贴壁后，分别按1∶1、5∶1、10∶1、20∶1 的效靶比，将培养8 d、静息2 d 的CAR-T 细胞与靶细胞混合，并设置培养基、效应细胞及靶细胞自发释放、靶细胞最大释放不同对照，每组均设3 个复孔，继续培养16 h后按LDH试剂盒说明检测培养上清的光密度（D）值，并计算细胞毒活性。细胞毒活性=（实验组D值-效应细胞自发组D值-靶细胞自发组D值）/（靶细胞最大组D值-靶细胞自发组D值）×100%。

1.7 ELISA法检测细胞因子分泌水平

同上以5∶1 的效靶比，将CAR-T 细胞分别与SKOV3、MDA-MB-453和MCF-7细胞共培养24 h，离心收集上清液，ELISA法检测IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的水平。

1.8 WB 法检测CAR-T 细胞STAT3 磷酸化水平及PD-1和TIM-3的表达

将SKOV3 细胞接种于24 孔板（2×104个/孔），细胞贴壁后，加入丝裂霉素C（50 μg/mL），继续培养4 h。然后按5∶1 的效靶比，加入培养8 d、静息2 d 的CAR-T 细胞继续培养4 h，收集各组上清液中悬浮的T 细胞，提取总蛋白。经SDS-PAGE，将蛋白质转移至PVDF 膜后，分别加入兔抗人STAT3（1∶500）、pSTAT3（1∶500）、PD-1（1∶1 000）、TIM-3（1∶1 000）或GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃过夜。TBST 洗膜后，加入HRP 标记的羊抗兔二抗（1∶5 000），室温下处理1 h。TBST 洗膜后，滴加ECL 显色液显影，采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。

1.9 FCM检测HER2-CAR-T细胞亚型

同1.8 按5∶1 的效靶比，将T 细胞与丝裂霉素C处理的SKOV3 细胞共培养24 h，收集各组悬浮的T细胞置于流式管中。分别加入抗人APC-CD45RO、抗人PE-CCR7抗体，4 ℃避光处理45 min，洗涤、重悬细胞，上FCM 检测初始T 细胞（TN）CCR7+CD45RO-、效应T 细胞（TEFF）CCR7-CD45RO-、中央记忆T 细胞（TCM）CCR7+CD45RO+及效应记忆T细胞（TEM）CCR7-CD45RO+等不同亚型T细胞的分布。

1.10 统计学处理

以上主要实验均重复3次。采用SPSS16统计软件对实验数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以表示，正态分布且方差齐的计量资料采用单因素方差分析进行比较，不符合方差分析的计量资料采用秩和检验的方法，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功制备携带靶向HER2的CAR的慢病毒

成功合成了两个CAR的全长DNA，即H28ξ-CAR和H28ξ(YRHQ)-CAR（图1A）。其中H28ξ-CAR胞内信号包括CD28 的穿膜和胞内段的68 个氨基酸（第151～218，GenBank:BC112085.1）以及CD3ζ 链胞内段112 个氨基酸（第52～163，GenBank:J04132.1）。H28ξ(YRHQ)-CAR 的CD3ζ 胞内段羧基末端倒数第6～9 个氨基酸由LHMQ 置换成YRHQ，其他与H28ξ-CAR相同。将H28ξ-CAR和H28ξ(YRHQ)-CAR分别经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，与经同样酶切的pCDH-CMV-GFP 载体链接，获得pCDH-H28ξ-CAR和pCDH-H28ξ(YRHQ)-CAR重组质粒。

FCM 检测慢病毒感染293T 细胞48 h 后的感染效率（图1B），经计算，病毒滴度（TU/mL）分别为1.72×108和1.65×108。

2.2 成功制备CAR-T细胞

FCM检测结果（图2A）显示，CD3+T细胞的纯度可达（94.3±3.4）%。两种携带HER2-CAR 的慢病毒以MOI=50感染活化48h的T细胞，培养5d后，H28ξ-CAR-T和H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞的CAR表达阳性率分别为（33.3±2.85）%和（28.30±3.2）%，显著高于激活的T细胞（P＜0.01，图2B）。此外，通过细胞计数观察到，两种HER2-CAR慢病毒感染T细胞后的第1、3天时，细胞增殖能力与T细胞比较差异无统计学意义（均P＞0.05），至第5和第7天时，两种HER2-CAR-T 细胞增殖明显减缓（P＜0.01或P＜0.05，图2C）。

2.3 SKOV3 和MDA-MB-453 细胞膜表面表达HER2抗原

细胞免疫荧光染色结果（图3）显示，SKOV3、MDA-MB-453 细胞膜可见HER2 表达，而MCF-7 细胞未见HER2表达。结果表明，SKOV3、MDA-MB-453为HER2阳性细胞，MCF-7为HER2阴性细胞。

2.4 引入YRHQ 基序可增强CAR-T 细胞对癌细胞的特异性杀伤活性

LDH 释放法结果（图4）显示，随着效靶比的增加，H28ξ-CAR-T 和H28ξ(YRHQ)-CAR-T 细 胞 对SKOV3、MDA-MB-453 细胞的杀伤作用逐渐增强（P＜0.05 或P＜0.01），当20∶1 的HER2-CAR-T 细胞与癌细胞共培养时，可杀伤40%以上的HER2+SKOV3或MDA-MB-453 细胞，但对HER2-MCF-7 细胞的杀伤作用较弱，而T细胞未见明显的细胞毒作用。在同一效靶比的情况下，H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞肿瘤特异性杀伤活性显著高于H28ξ-CAR-T 细胞（均P＜0.05）。结果表明，引入YRHQ 基序可增强CAR-T 细胞对HER-2+细胞的特异性杀伤活性。

2.5 引入YRHQ基序可促进CAR-T细胞IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的释放

ELISA 检 测 结果（图5）显 示，与SKOV3 和MDA-MB-453 细胞共培养后，H28ξ-CAR-T与H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞均可释放高水平的IL-2、IFN-γ和颗粒酶B，与T 细胞比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。其中，H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞释放的IL-2、IFN-γ和颗粒酶B水平显著高于H28ξ-CAR-T细胞（均P＜0.01）。结果表明，引入YRHQ 基序可促进CAR-T细胞IL-2、IFN-γ和颗粒酶B的释放。

2.6 引入YRHQ 基序提高CAR-T 细胞的STAT3 磷酸化水平

按效靶比5∶1，将H28ξ-CAR-T 和H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞与SKOV3细胞共培养4 h后，WB法检测结果（图6）显示，与T细胞组和H28ξ-CAR-T组比较，H28ξ(YRHQ)-CAR-T 细胞p-STAT3 蛋白水平明显升高（P＜0.01）；而该两种HER2-CAR-T 细胞与SKOV3细胞共培养24 h 后，细胞中TIM-3 和PD-1 的表达与T 细胞比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。结果表明，引入YRHQ 基序可提高CAR-T 细胞的STAT3磷酸化水平，且未明显增加T细胞耗竭。

2.7 引入YRHQ基序促进CAR-T细胞向TEM细胞分化

FCM检测结果（图7）显示，培养到第10 天的T细胞及两种CAR-T细胞主要为TCM(CCR7+CD45RO+)表型。经SKOV3细胞刺激24 h 后，包含YRHQ 基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T 细胞中TEM的比例显著增加（P＜0.05），TCM细胞的比例显著下降（P＜0.05）。结果表明，引入YRHQ基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞不仅获得了持久性特征，同时其抗肿瘤活性也明显增强。

3 讨论

磷酸化的ZAP-70与CD3ζ的ITAM结合，在抗原诱导T 细胞活化过程中发挥重要作用[12]，因此，目前在CAR 的设计上主要选择CD3ζ 链来实现胞内第1信号的转导。有研究结果[13]表明，改变CD3ζ 链的结构可以影响CAR-T细胞的活性，如截断CD3ζ链胞内区结构域，保留1 或2 个ITAM 基序，可明显降低CAR-T 细胞的活化，促进免疫记忆的形成，有利于CAR-T 细胞抗肿瘤活性的持久性。减少CD3ζ 链的ITAM数量，势必会抑制NF-κB、NF-AT转录因子的活化。但也有研究结果[14]表明，增加胞内信号强度，上调CAR-T细胞内转录因子NF-κB和NFAT的活性，有利于防止CAR-T 细胞的衰竭，提高其抗肿瘤的能力。降低或增强的胞内信号，可能会通过影响转录因子谱及活性来优化CAR-T 细胞基因的表达，进而通过平衡相关基因的表达水平影响CAR-T细胞的分化和抗肿瘤作用。因此，CAR-T 细胞功能由胞内信号的质量或类型而非仅仅是数量来控制。

本研究制备了含有CD28共刺激信号的第二代CAR（即H28ξ），其中，识别抗原的ScFv来源于本实验室制备的抗人HER2单抗V区的PCR产物[11]。CD28作为T细胞的共刺激信号，可通过其下游PI3K-Akt信号通路，为CAR-T细胞提供可克服Treg细胞介导的免疫抑制性肿瘤微环境的强大信号[15]。为了进一步平衡CAR-T细胞的胞内信号，将CD3ξ链C末端的4个氨基酸LHMQ替换为YRHQ，制备了H28ζ(YRHQ)-CAR。YRHQ氨基酸基序是胞内STAT3的结合位点[16]。STAT3不仅作为JAK/STAT通路中重要的转录因子，活化后参与诱导IL-2、IFN-γ等多种细胞因子及颗粒酶B的转录，并通过调控转录调节因子Eomes、BCL-6和Blimp-1的表达，调节记忆性CD8+T 细胞分化，维持CD8+T细胞效应功能与免疫记忆的平衡[17-19]。

利用携带上述CAR的慢病毒感染人外周血T细胞制备的CAR-T细胞，体外培养的前3 d，CAR-T细胞与未感染慢病毒的T细胞增殖水平无明显差异，但在体外培养的第5和第7天时，CAR-T细胞的增殖能力明显减缓，说明CAR-T细胞的体外培养系统仍需要进一步改进。通过评估CAR-T 细胞的效应功能，可以看出H28ξ-CAR-T和H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞均可特异性识别并有效杀伤表达HER2抗原的肿瘤细胞；引入YRHQ基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞，对肿瘤细胞的特异性杀伤活性及IL-2、IFN-γ和颗粒酶B分泌水平均高于H28ξ-CAR-T细胞。进一步观察到H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞STAT3 蛋白磷酸化水平明显高于T 细胞和H28ξ-CAR-T细胞，说明引入YRHQ基序可以通过调控转录因子STAT3的活性提高CAR-T细胞的活化水平。另外，H28ξ-CAR-T细胞也有一定水平的STAT3蛋白发生磷酸化，这可能是使用CD3抗体联合IL-2激活T细胞后产生的本底信号。

PD-1、TIM-3 均为T 细胞耗竭的标志物。表达PD-1的CAR-T细胞与表达PD-L1的肿瘤细胞相互作用后会抑制CAR-T 细胞的活化[20-22]；TIM-3 阳性的CD8+T 细胞存在STAT5 通路受损，而阻断TIM-3 途径可促进T 细胞释放IFN-γ，增强抗肿瘤作用[23]。本研究结果显示，当H28ξ-CAR-T 和H28ξ(YRHQ)-CAR-T 细胞分别与SKOV3 共培养24 h 后，PD-1 与TIM-3蛋白表达均未见明显改变，表明引入YRHQ基序后，虽然CAR-T细胞中STAT3活性水平升高，但肿瘤抗原的刺激未因CAR-T细胞活性增强而表现出耗竭状态。此外，有研究结果[24]表明，CAR-T 细胞STAT3激活有利于其抵抗凋亡。当CAR-T细胞在肿瘤抗原持续刺激的情况下，YRHQ 基序是否会影响CAR-T细胞的耗竭，有待在后续工作中深入研究。

本研究对两种CAR-T细胞在肿瘤细胞刺激前后的分化状态也进行了分析，结果表明，整合了YRHQ基序的CAR-T细胞能显著提高TEM（CCR7-CD45RO+）细胞亚群的比例，而TCM（CCR7+CD45RO+）细胞亚群的比例明显下降。TCM细胞组成性表达CCR7和L-选择素CD62L，与初始T细胞相似，可趋化到淋巴结，在抗原刺激后可稳定增殖，产生大量IL-2，但无细胞毒效应；而TEM细胞的特点是失去CCR7的表达，增加向炎症部位趋化的能力，遇到抗原刺激，可快速释放IFN-γ 和颗粒酶B 等效应分子，具有保护性记忆功能[25-26]。TEM细胞比例的增加表明，整合了YRHQ 基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T细胞在识别肿瘤抗原后可快速激活发挥细胞毒作用。YRHQ 的引入是否会影响CAR-T 细胞抗肿瘤活性的持久性，本课题组将在后续的研究中继续进行探索。

综上所述，本研究验证了通过在CAR 的胞内信号分子CD3ζ 链整合YRHQ 基序能以抗原依赖的方式为CAR-T 细胞传递激活信号，此研究为通过修饰CAR 胞内信号来提高CAR-T细胞的抗肿瘤能力提供了新思路。