共培养的水分状态对农杆菌转化玉米的影响

吕孟雨 董福双 张俊敏 王海波

摘 要：农杆菌与受体的共培养条件，对农杆菌介导的遗传转化有着重要的作用，为了提高玉米芽生长点的遗传转化效率，以郑58玉米自交系的种子为试验材料，用EGFP（增强型绿色荧光蛋白）基因作为标记基因，通过控制农杆菌共培养时的水分提供方式，研究共培养时的水分条件对农杆菌转化玉米芽生长点的影响。结果表明，将转化的玉米种子放到加有2层滤纸的培养皿中，每培养皿放置10～15粒种子，加1.5 mL无菌水，放在25 ℃暗培养3～4 d，在不影响转化效果的基础上有利于转化后发芽，可获得较多的转化材料。

关键词：玉米；农杆菌转化；共培养；水分

中图分类号：S513 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.12.003

Abstract： The co-culture condition of agrobacterium and its receptor plays an important role in the agrobacterium-mediaed genetic transformation. The purpose of this study is to improve the genetic transformation efficiency of maize bud growth point. Using the seed of maize inbred line Zheng 58 as the experimental material， EGFP （enhanced green fluorescent protein） gene as reporter， and by controlling the water supply in agrobacterium co-culture， the effect of water condition on the growth point of maize germinating was studied. The results showed that when the transformed maize seeds was cultured in petri dishes with 2 layers of filter papers and 10～15 seeds and 1.5 mL sterile water for 3～4 d at 25 ℃ in dark， it was beneficial to germinate after transformation without affecting the transformation effect， and took more transformants.

Key words： maize； agrobacterium-mediated transformation； co-culture； moisture

玉米是全球分布最廣的粮食作物，是世界重要的三大粮食作物之一，也是中国最重要的作物之一[1-2]。转基因玉米作为生物技术产业化的重大成果，已在世界各地普遍应用，转基因玉米在我国的产业化应用也将是大势所趋，应在技术上和管理上及早准备[3]。研究玉米的遗传转化技术具有重要意义，玉米遗传转化的方法主要有PEG法、花粉管通道法、农杆菌法、基因枪法、电激法、子房注射法等，其中，农杆菌法和基因枪法使用较多[4]。农杆菌法具有成本低、外源基因拷贝数低、外源基因能稳定遗传表达等特点，更适用于规模化转基因技术体系[1]。在农杆菌介导的遗传转化中，农杆菌侵染外植体必须有一定的时间，才能使农杆菌充分吸附到外植体的表面，此过程中许多因素的变化对转化效率有较大的影响[5-6]。有关农杆菌转化效率的影响因素已有大量研究报道[5，7-8]，但仍有许多未涉及的问题需要进一步探讨。

共培养阶段是农杆菌侵染转化的关键阶段，共培养条件不同将直接关系转化是否成功，从而影响农杆菌对玉米的转化效率，水分是共培养的重要因素之一，在共培养中如何控制水分是研究农杆菌转化的一个重要方面。

玉米茎尖是近几年遗传转化中广泛应用的一种受体材料，与幼胚及其胚性愈伤组织等受体材料相比，茎尖作为受体材料具有简单易行、周期短、效率高、取材不受季节限制等优点。GFP作为辅助性筛选标记基因可以直观、快速和有效地消除玉米遗传转化工作中的假阳性现象；近几十年来，GFP绿色荧光蛋白作为可视标记在生物学研究的各个领域均得到了广泛的应用，成为了生物学研究最重要的手段之一[9]。

本研究利用GFP绿色荧光蛋白作为可视标记观察转化效果，在共培养阶段，将已经在玉米芽生长点上滴加农杆菌侵染液的玉米种子，放到不同的水分状态下进行共培养，目的是研究共培养时玉米种子处于不同的水分状态下对农杆菌转化玉米的影响，为提高玉米芽生长点的转化效率提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

利用玉米自交系郑58的成熟种子，将种子发芽后剥出的芽生长点作为转化受体。

所用载体PEGAD（Ubi+EGFP）由河北师范大学提供，含有增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP），将35 S启动子替换为ubiquition启动子改造而成（图1）；所用农杆菌菌株为EHA105，由河北省植物转基因中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子发芽 将玉米种子清洗后，用0.1%的HgCl2消毒12 min，再用无菌水冲洗5遍，将消毒的种子放在加有2层滤纸经过高温消毒的培养皿中（培养皿直径9 cm），每培养皿放20粒玉米种子，5个培养皿共100粒种子，每个培养皿分别加8 mL浓度为70 μmol·L-1的AS（乙酰丁香酮）水溶液，在25 ℃暗培养3 d。

1.2.2 农杆菌介导转化液的制备 挑取农杆菌单菌落，接种到50 mL含有50 mg·L-1硫酸卡那霉素+40 mg·L-1利福平的LB液体培养基中，于28 ℃，210 rpm条件下振荡培养至菌液OD600=0.5时，4 000 r·min-1，5 ℃离心5 min收集菌体，弃上清液，悬浮于1 mL的高渗侵染基液。高渗侵染基液配方为：1/10 MS培养基的盐+ 68.5 g·L-1蔗糖+30 g·L-1葡萄糖+400 mg·L-1 MES +100 μmol·L-1乙酰丁香酮+100 mg·L-1普朗尼克F68，pH值为5.4～5.6，摇匀制备成农杆菌介导转化液。

1.2.3 转化处理与检测 当玉米种子浸种发芽3 d以后进行转化处理，将发芽的种子在4 ℃冷处理31 h，然后在工作台上放置30 min，用手术刀剥出玉米芽生长点。处理1：放入加有2层滤纸的培养皿中，处理1共转化3个培养皿，每培养皿放10粒种子，在-18 ℃處理20 min，放置30 min，用农杆菌侵染液转化处理，转化30 min后，加1.5 mL水，盖盖后密封，放在23～25 ℃温度条件下暗培养4 d，然后每培养皿加10 mL水，25℃光照培养。处理2：将剥出生长点的玉米种子放入1 mL的枪头盒中，其中一盒放20粒种子，另一盒放17粒种子，在-18 ℃处理20 min，放置30 min，用农杆菌侵染液转化处理，转化30 min后，每盒加20 mL水，盖盖后密封，放在23～25 ℃温度条件下暗培养4 d，然后每枪头盒加20 mL水，进行光照培养1 d，转接到加有2层滤纸的培养皿中，每培养皿放10粒种子加10 mL水，进行光照培养。转化7 d后，用荧光显微镜对转化芽进行荧光蛋白检测，比较2个处理的转化效果和转化芽的获得情况。

2 结果与分析

2.1 共培养条件对玉米发芽的影响

转化后经过共培养6 d后玉米种子的出芽率，处理1为43.3%，处理2为12.5%；玉米种子的芽长度处理1较长，处理2很短（图2c），说明处理2对转化后玉米种子的发芽不利，获得的转化玉米芽较少。由此可见，使玉米种子直接接触一定的水分（处理1），比只在湿度较大的水环境中（处理2）更有利于发芽。

2.2 共培养条件对转化的影响

通过对转化芽绿色荧光蛋白的检测结果可知（图3），处理1与处理2转化后长出的玉米芽绿色荧光蛋白的表达亮度差异不明显，表明这2种共培养方式对于农杆菌的侵染转化效果基本没有差异，农杆菌对玉米芽生长点的转化需要的水分并不多，只要有一定的湿度即可完成侵染转化过程，但水分过少时转化后生长出的芽小，不利于转化苗的形成。

3 讨 论

共培养是农杆菌中T-DNA 携带外源基因进入植物细胞的关键时期。张丽君等[10]将第2 次超声处理后的微创伤种子浸泡在含有目的基因农杆菌菌液中，于摇床上振荡（ 120 r·min-1） 培养1～3 d，由于转化材料为种子，需要考虑种子的发芽情况，共培养时间以2 d 较合适；共培养时间太短，农杆菌没有充分地对植物进行转化，转化率较低；而共培养时间太长，胚细胞呼吸作用逐渐加强，酶的活动逐渐旺盛，加速消耗氧气，使得共培养液中氧气含量减少，营养情况不良，并容易大量产生、积累次级代谢产物，可能产生有害物质。由于他们利用农杆菌液与受体材料进行共培养，使得共培养时间不宜超过2 d，采用将农杆菌侵染液添加到玉米芽生长点上，向培养皿中添加少量的水，使玉米种子可以吸收到少量水分保持一定湿度，又不影响种子正常呼吸作用，这样进行共培养，可以使共培养的天数增加到3～4 d，保证有充分的时间完成农杆菌的转化过程，使更多的细胞得到转化，又不会危害芽的生长。如果不使种子接触到水分，仅保证种子处于较高的湿度环境，虽然可以完成农杆菌的转化但对转化芽的生长不利，不易获得转化植株。采用加较少的水分，在培养皿中密闭的方法共培养，有利于农杆菌完成转化和获得植株。

参考文献：

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